气相色谱-质谱法测定麝香保心丸挥发性入血成分

气相色谱-质谱法测定麝香保心丸挥发性入血成分

麝香宝心丸是国家保护的中药品种。它是由麝香、人参、苏米安、肉桂、干草、黄埔和婆罗洲七种药物组成的。临床上主要用于冠心病,动脉粥样硬化,心肌缺血及心肌纤维化等的治疗,效果显著。现代药理研究表明,麝香保心丸具有一系列药理活性,其可提高NO的水平、提高内皮型NO合酶基因的表达等作用以及能减轻微小血管的损害,下调MMP-2mRNA和蛋白表达,改善心肌缺血引起的心肌坏死等,尽管对其整体药效机制评价较多,但其主要药理活性成分,即复方主要药效物质尚未得到充分阐明。由于中药复方为中医药理论指导下的多味药材经配伍组合后的有机整体,先前的生物活性导向下的植化系统分离模式不能完全阐明中药复方的药效物质,因为它忽略了中药复方整体作用机制,而且不能反映中药复方中的化学成分体内动态变化过程。近年来,中药血清药物化学研究已经成为快速筛选中药体内活性成分的一种有效手段。该技术基于“口服中药经胃肠道吸收入血的成分有最大可能成为真正药效成分”的理论,广泛应用于多个中药复方药效成分的筛选,成果显著。麝香保心丸含有的植物二次代谢产物主要分为挥发性成分与非挥发性成分组成。本课题组前期研究已经阐明了其主要非挥发成分,但麝香保心丸中挥发性成分尚未完全探讨。因此,本研究基于中药血清药物化学理论,建立气相色谱-质谱法(GC-MS)定性分析中药复方麝香保心丸挥发性入血成分,拟为中药复方的药效物质研究提供技术手段。1仪器和试剂盒1.1超声清洗器测试质谱仪:ThermoGCDSQⅡ气相色谱仪;Xcalibur色谱工作站;KS5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);BP211D型电子天平(德国Sartorius);AnkeTGL-16C型离心机;VortexQL-901型涡旋器。1.2对照品及试剂麝香保心丸制剂由上海和黄药业有限公司提供(批号080105),麝香酮(批号M0128)、肉桂酸(批号ASB-00003655-025)、肉桂醛(批号YY90307)、龙脑(批号M0297)、异龙脑(批号111512)5种对照品均购自中国药品生物制品检定所,苯甲酸苄脂购自上海鼎瑞化工有限公司。戊巴比妥钠、肝素钠均购自国药集团化学试剂有限公司。正己烷、乙醚、丙酮、氯仿均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。1.3动物许可证号scxk思想SPF级雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物许可证号SCXK(沪)2003-0003,实验前禁食12h(自由饮水)。2方法和结果2.1香茶保心丸分析与胃注射2.1.1醚混悬液的制备精密称定麝香保心丸样品500mg,研细,于10ml容量瓶加入乙醚混悬,超声提取20min,冷却至室温,乙醚补足损失体积,静置取上清,同法提取两次,滤液合并,12000r/min离心10min。取上清液过0.45μm微孔滤膜,1μl进样GC-MS分析。2.1.2对照溶液的制备分别精密称取各对照品适量,于10ml容量瓶中加乙醚至刻度,4℃冰箱中冷藏,备GC-MS分析。2.1.3大鼠的给药与麻醉精密称定麝香保心丸样品适量,研细,于锥形瓶中加入0.5%羧甲基纤维素钠制成混悬液(浓度:0.34g/ml)。20只SD雄性大鼠随机分为溶剂对照组与给药组,每组10只,溶剂对照组大鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌服。给药组大鼠给予麝香保心丸混悬液灌服(剂量:3.4g/kg)。服药30min后,所有大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠溶液(剂量:0.15ml/kg)麻醉。肝门静脉取血5ml,置于涂肝素钠的EP管中,4℃,3000r/min离心10min,取上清液,-80℃冰箱冷冻,备用。2.2梯度升温程序ThermoTR-5ms色谱柱;Xcalibur色谱工作站;载气为氦气;载气流速1.0ml/min;进样口温度220℃;离子源温度250℃;进样体积1μl;梯度升温程序见表1;分析时间59min。2.3扫描电子文件进样各对照品溶液,优化GC-MS参数,优化的质谱条件:EI源,电子能量70eV,扫描速度5次/s,发射电流100μA,扫描周期3642amu/s,离子源温度250℃,扫描质量范围10～650u。数据分析采用Xcalibur色谱工作站。2.4检测分析方法于5mlEP管中加入血浆样品250μl,乙醚1ml,涡旋1min,12000r/min离心10min,取上清液,同法萃取两次,合并上清,真空旋转蒸干,残渣加入50μl乙醚复溶,离心,取上清液1μl进样GC-MS分析,比较溶剂对照组与给药组质谱图,确定麝香保心丸入血成分。质谱鉴定过程:于40～500u范围内,分别对空白血浆,给药血浆以及麝香保心丸提取液的GC-MS色谱图以1μl为间隔单位进行提取,即分别提取40、41、42、498、499及500等离子,对提取离子色谱图进行比较,分析空白血浆和给药血浆离子峰度差异,以此鉴定化合物结构。结果如表2所示。2.4.1不同提取离子的方案由于空白血浆与给药血浆的质谱离子流图几乎相同,背景噪音掩盖了目标化合物的响应值。为扣除噪音干扰,本研究采用提取离子的方法对空白血浆与给药血浆图谱进行处理。设定提取离子波动范围±0.5u,原型化合物鉴定方法如上所述,如提取离子m/z55,空白血浆与给药血浆图谱如图1所示。给药血清图谱中于36.8min处出现一差异峰,通过与对照品及NIST05数据库比对,该化合物最终被确定为麝香酮。同理,龙脑、异龙脑、苯甲酸苄酯、肉桂醛及肉桂酸经同样方法鉴定。2.4.2不同留时间前3个月内开发不同保心丸提取液的代谢成分测定代谢产物鉴定方法如上所述,当提取离子为m/z108时,给药后血清和空白血清的提取离子色谱图如图2所示。通过给药血浆与空白血浆对比,于保留时间25.7、26.6及26.9min处的出现3个差异峰,且在麝香保心丸提取液色谱图中未见,提示其可能为代谢成分。经过NIST05数据库比对,3个化合物被鉴定bicycleheptan-2-ol,2-allyl-1,7,7-trimethyl,2,6,10-trimethyltetradecane及2-butyl-5-methyl-3-[2-methylprop-2-enylcyclohexanone。3龙脑的人工叶片本文基于气相色谱-质谱联用技术,对中药复方麝香保心丸挥发性入血成分进行研究,共确认10个入血成分,包括6个原型成分及4个代谢产物。在已鉴定的这些成分中,很多化合物对心血管疾病有着积极的治疗和预防作用。如肉桂中的肉桂醛能够抑制TNF-α诱导的细胞粘附因子的产生,可以减少血小板聚集和血栓形成,有利于对抗动脉粥样硬化。麝香酮抑制血管内皮细胞与中性粒细胞黏附及其表面ICAM-1、VCAM-1和CD44表达,有利于缓解心血管内皮细胞损伤后的炎症反应。只含有龙脑和异龙脑的人工冰片则能使冠状窦血流量回升,减慢心率,降低心肌氧耗量。这些化合物对于心血管积极的治疗作用也从另一方面验证了本研究的可靠性。本研究过程中的方法学优化及结果如下:本研究分别考察了不同给药剂量(0.8、1.7和3.4g/kg)大鼠血浆中的入血成分,经对比GC-MS图谱主要化合物特征离子(麝香酮m/z55、肉桂酸m/z147、龙脑和异龙脑m/z95)峰度,发现麝香保心丸中主要的挥发性成分在3.4g/kg剂量下的色谱峰较高,所以给药剂量选择为3.4g/kg。本研究分别考察了不同取血时间(15、30、60min)大鼠血浆中的入血成分,从提取特征离子色谱峰中发现,30min时间点的血浆样品质谱图中发现麝香酮、肉桂酸、龙脑和异龙脑均有色谱峰出现,给药60min后取血浆样品质谱图中各目标离子的提取离子色谱峰变小,冰片中龙脑、异龙脑的色谱峰甚至消失。所以选择30min为最佳时间点。本研究分别考察了不同前处理方法对入血成分的影响,经比较,乙醚溶液比正己烷/氯仿(10:1)混合溶液提取效率要高,正己烷/氯仿(10:1)混合溶液对麝香酮提取效果较差,所以最终选择乙醚萃取法作为处理血样方法。综上所述,本研究建立了一种快速筛选中药复方麝香保心丸中挥发性入血成分的方法,麝香保心