气相色谱-质谱联用法测定杭白菊挥发油中-榄香烯的含量

气相色谱-质谱联用法测定杭白菊挥发油中-榄香烯的含量

菊花是由中国卫生部发布的两种中药资源组成的。现有研究表明,菊花中所含的挥发油与其生理活性密切相关。不同地域,不同品种菊花挥发油各组分相对含量明显分布不同,但化学成分基本为单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物等。其中,单萜类成分主要有:樟脑、龙脑、a-侧柏酮、β-蒎烯、1,8-按叶素等;倍半萜类成分主要有:金合欢醇、金合欢烯、a-荜澄茄醇、衣兰油醇、姜烯等。研究认为,挥发油是菊花抗菌作用的物质基础,而樟脑、龙脑则是发挥抗菌作用的主要成分。实验采用水蒸汽蒸馏法从杭白菊中提取挥发油,利用气相色谱-质谱联用技术对其化学成分进行分析。发现菊花挥发油含有β-榄香烯后,因榄香烯具有显著的抗癌活性,榄香烯乳注射液是我国自主研发成功的二类抗肿瘤新药,目前已经用于癌症病人的临床治疗,本实验对杭白菊中β-榄香烯的含量进行测定。1材料和方法1.1菊花挥发油的制备干燥杭白菊,经江苏省质检局鉴定为菊属植物杭白菊的干燥花蕾;菊花挥发油为本实验室制备;β-榄香烯(批号100268-200401,含量99.2%)中国药品生物制品检定所。1.2仪器Agilent6890Plus/5973N气相色谱-质谱联用仪美国安捷伦公司。1.3方法1.3.1挥发油的相色谱分析杭白菊挥发油用环己烷稀释100倍后进行GC-MS分析,经毛细管气相色谱分析,以面积归一化法计算各化学成分在挥发油中的相对百分含量,通过AgilentMSD化学工作站检索,Wiley275.L标准质谱图库及NBS75K.L质谱图解析确认其化学成分。1.3.1.高纯抗钢柱的生长特性HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)毛细管柱;载气为高纯氦气,柱流量为1.0ml/min;进样量2μl;进样口温度280℃;柱温:起始温度35℃;保持5min,以5℃/min升至150℃保持5min。1.3.1.扫描质量及剂量EI电离源,电离电压70eV,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,接口温度280℃,扫描质量范围50~550amu,溶剂延迟6min。1.3.2正十二烷内标溶液的配制选用正十二烷作为β-榄香烯的内标物。精密称取正十二烷603.40mg,用正己烷定容至10ml作为内标储备液,该储备液再以正己烷稀释成603.40μg/ml正十二烷的内标溶液。1.3.2.对照品溶液的制备精密称取β-榄香烯160.0mg,以正己烷溶解并定容至10ml,制成16.0mg/ml的对照品储备液,摇匀备用。该储备液再以正己烷稀释成160.0mg/ml的标准应用液。1.3.2.标准溶液的配制25g粉碎杭白菊,按优化方法进行提取菊花挥发油,正己烷定容于1.5m1量瓶中后,精密移取0.1m1置于另一个1ml量瓶中,精密加入50μl内标溶液,用正己烷溶解并定容至1ml。1.3.2.研究方法AgilentHP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)。程序升温70℃,2.5℃/min至140℃,再以10℃/min至260℃,气化室温度280℃,检测器FID温度300℃,氦气流速1ml/min,进样1μl。2结果与分析2.1挥发油的化学成分杭白菊挥发油经毛细管气相色谱分析,共分离出125个峰,鉴定出59种化合物,占挥发油总量的61.74%,所认定挥发油中的各种化学成分及其峰面积相对百分含量见表1,其总离子流图见图1。2.2-在菊花中燃烧2.2.1-榄香烯标准曲线对照品溶液及样品供试液按1.3.2条件进样,各个峰可分离,标准品及样品色谱图见图2、3。从标准应用液中精密移取β-榄香烯600、300、150、75、37.5μl,并分别添加内标50μl,制备β-榄香烯测定标准曲线为C=89.434x+2.2075,r=0.9995,线性范围为0.006~0.096mg/ml。2.2.2相对标准偏差取标准曲线制备中间点的标准溶液测定,按上述色谱条件进样1μl测定峰面积,计算标准峰面积与相应内标峰面积之比,得β-榄香烯的相对标准偏差为1.68%(n=5),结果见表2。2.2.3重复性试验结果取同一杭白菊样品5份,平行提取、测定待测组分峰面积与响应内标峰面积之比,结果见表3,结果显示β-榄香烯的相对标准偏差为0.85%(n=5),表明本法重复性较好。2.2.4进样稳定性试验取同一份供试液,于0、1、3、7、24h分别进样,计算待测成分峰面积与相应内标峰面积之比,得β-榄香烯的RSD为1.1%(n=5),表明样品在24h内稳定,结果见表4。2.2.5样品的测定回收率采用加样回收率实验,称取已测知含量的杭白菊25g,共3份,按高、中、低三个水平分别精密加入一定量标准品,进行β-榄香烯的测定,计算回收率。由表5结果可知,以本法测定杭白菊挥发油中β-榄香烯的含量具有较高的回收率。测得25g杭白菊中β-榄香烯的含量为324.6μg,在杭白菊中含量为1.298mg/100g。3杭白菊挥发油中-榄香烯含量测定由表1可以看出,杭白菊挥发油的主要成分为单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物等。其中,2-甲基-1-戊烯、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、β-榄香烯、正葵酸、反-β-合金欢烯、姜黄烯、α-香柠檬烯、β-没药烯、β-杜松烯、环氧石竹烯、β-马榄烯、α-木香醇、十六烷酸、9,12-十八碳二烯酸、二十三碳烷、二十五烷的含量在杭白菊挥发油中的相对含量大于1%。参照相关文献发现,樟脑、龙脑和β-榄香烯在杭白菊挥发油中普遍存在且含量偏差不大,但在本实验中测得的石竹烯氧化物含量远远高于文献值。另外,实验还发现了文献中未报道过的新物质β-马榄烯和香木兰烯,β-马榄烯是日用化工天然的调香原料,香木兰烯可用于香料原料及试剂。萜类化合物是存在于植物界的常见化合物,其生物活性是多方面的,并且是某些中药的主要有效成分。杭白菊挥发油中的主要萜类化合物有蒎烯、龙脑、乙酸龙脑酯、姜黄烯等;龙脑,乙酸异龙脑酯具有镇痛抗炎、发汗作用;樟脑具有清凉、止痒、镇痛、抗菌等作用;姜黄烯具有清除自由基作用;松油醇具有较强的平喘作用;β-榄香烯具有抗肿瘤作用和提高机体免疫力的作用,此外还具有抗菌、抗病毒、改善微循环等作用等,榄香烯还能干扰癌细胞的生长代谢,抑制癌细胞增殖,最终杀死癌细胞,是抗癌的有效活性物质;石竹烯可作香料;α-蒎烯有明显镇咳和祛痰功能,并有抗真菌(如白念珠菌)作用,此外,α-蒎烯、β-蒎烯还有驱虫、杀虫、除螨的作用。本研究通过对杭白菊挥发油含量和有效成分的分析,进一步明确了其中成分,对今后开发利用杭白菊成为保健食品及综合利用提供了科学依据。另外,实验采用气相色谱内标法测定了菊花挥发油中具有抗肿瘤作用的β-榄香烯的含量,内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时,加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响,以提高分析结果的准确度。内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时,在样品中加入一定量的标准物质,它可被色谱所分离,又不受试样中其它组分峰的干扰,只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值,即可求出待测组分在样品中的百分含量。内标法定量,克服了外标法定量对操作要求高、准确度低的缺点。本实验采用正十二烷作为β-榄香烯测定的内标,实验证实,它在色谱条件下和目标峰分离良好,符合内标选择的要求。本实验中测得25g杭白菊中β-榄香烯的含量为324.6μg,在杭白菊中含量为12.98mg/kg,通过质谱分析在杭白菊挥发油中所占百分含量为1.22%,比文献