双黄连粉针剂及其提取物的血浆药物化学研究

双黄连粉针剂及其提取物的血浆药物化学研究

双黄连粉剂由蜂蜜、连翘和黄鼠尾提取物制成。具有强烈的抗菌和抗癌作用。常用于病毒性肺炎、上呼吸道感染等病毒和细菌感染疾病的治疗。然而，近年来，该注射剂的副作用引起了许多医生的关注。本实验旨在通过研究比较双黄连粉针剂给予大鼠灌胃后入血化学成分的变化,为阐明双黄连粉针剂体内药效物质基础,进一步优化双黄连粉针剂的处方提供实验依据。1材料表面1.1对照品的制备黄芩苷(批号715-9003)、绿原酸(批号110753-200212)、连翘苷(批号0821-9903)、黄芩素(批号111595-200301)等对照品购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈为色谱纯(FisherCompany,Inc.美国),水为超纯水,其他试剂均为市售分析纯。双黄连粉针剂(处方中金银花、连翘及黄芩等药材的比例为1∶2∶1)及金银花、连翘、黄芩提取物均由哈药集团中药二厂提供。1.2动物清洁级SD系雄性大鼠,体重250~300g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号SCXK(京)2002.003。1.3洗脱系统及色谱美国Angilent1100高效液相色谱仪,包括四元梯度洗脱系统,DAD检测器,Angilent色谱工作站;CleanertSPEODS-C18固相萃取小柱(美国艾杰尔科技公司)。2方法2.1对照品溶液的制备精密称取绿原酸、连翘苷、黄芩苷、黄芩素对照品适量,加甲醇溶解并制备成含上述对照品0.044,0.19,0.04,0.01mg·mL-1的混合标准品溶液,过0.22μm微孔滤膜,即得。2.2加甲醇法提取其他样品分别精密称取双黄连粉针剂和各单味药提取物适量,加甲醇分别制成含上述各样品1.067,3.0,0.121,1.067mg·mL-1的溶液,过0.22μm微孔滤膜,即得。2.3柠不同给药量的制备取雄性SD系大鼠,禁食12h,但自由饮水,灌胃给予双黄连粉针剂及各单味药提取物的供试液3mL(2.16g·250g-1),腹腔注射20%乌拉坦生理盐水溶液(1.8g·kg-1)麻醉,做颈动脉插管,分别于给药后15,30,60,90,120,180,240min取血0.5mL,用3.8%柠檬酸钠抗凝(血液与柠檬酸钠溶液的比例是9∶1),4000r·min-1离心10min,分取血浆,用0.1mol·L-1盐酸调pH3~4,加于SPE固相萃取小柱上,先用0.5mL水洗脱,弃去洗脱液,再用2%(pH4)酸性甲醇10mL洗脱,收集洗脱液,低温挥干,残渣用300μL甲醇复溶,以0.22μm微孔滤膜滤过,即得。精密吸取20μL供HPLC测定。2.4u3000酸、流速及洗脱程序迪马公司C18钻石色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);梯度洗脱,流动相A为乙腈,B为1%醋酸,流速1mL·min-1;梯度洗脱程序:0~20min,A15%~20%;20~32min,A20%~37%;32~40min,A37%~40%;40~50min,A40%~50%;50~60min,A50%~15%。柱温25℃;波长采集范围190~400nm;检测波长280nm。2.5回血成分及来源检测取双黄连粉针剂及各单味药提取物的供试品溶液、对照品液、双黄连粉针剂及各单味药提取物的血浆以及空白血浆样品在相同色谱条件下进行HPLC分析,建立HPLC色谱图,比较确定入血成分及其来源。上述3种药材提取物与双黄连粉针剂谱峰相关性的研究:按照文献报道方法分别求算双黄连粉针剂与上述3种药材提取物指纹图中相匹配谱峰保留时间的相对标准偏差,说明两峰之间的相关性。3灌胃后不同时间的血浆hplc分析大鼠灌胃双黄连粉针剂90min后,血浆HPLC图谱中可见8个主要成分;其中1,2,3,5,7,8号峰为双黄连粉针剂中原形成分,而4,6号峰为新出现的代谢产物。经与各提取物进行比对,1号峰为绿原酸,5号峰为黄芩苷,8号峰为黄芩素。与双黄连原液的HPLC图谱比较,双黄连粉针剂90min后的HPLC指纹图谱可见2号峰的峰面积的相对比例明显增大,而5号峰面积明显减小。通过对4,6号峰的DAD光谱检测分析发现,其与黄芩苷的光谱极为相似,疑为黄芩苷的代谢物。未发现连翘的几个主要成分(包括9号峰的连翘苷)有明显的入血吸收(图1)。金银花、连翘、黄芩提取物大鼠灌胃后不同时间的血浆HPLC指纹图谱见图2~4。金银花提取物灌胃给药30min后(图2)可检测出绿原酸(1号峰),同时还出现了金银花提取物中没有的新成分,即5~8号峰;60min后(图2)又出现了1个金银花提取物中的原形成分(4号峰),而6,7号峰面积减小,8号峰面积明显增高;90min后(图2)未见绿原酸及6,7号峰的相对峰面积发生较大变化,而5号峰的相对面积明显增大,8号峰面积变小。连翘提取物大鼠灌胃给药后,各时间点均未检测到连翘苷。有文献报道证明,连翘苷在体内无论单独给药或与其他吸收促进剂一起给药,在胃、小肠及结肠均不被吸收。但本实验中发现连翘提取物中其他成分有少量入血,同时出现了2个新成分(图3)。黄芩提取物大鼠灌胃后在测定的240min(图4)内黄芩苷的吸收呈现了双峰现象,并且在240min时达到峰值,与文献报道的黄芩苷吸收存在肝肠循环相符。HPLC谱图中的2号峰经采用标准加入法确认其为黄芩素。通过比较口服黄芩提取物及双黄连粉针剂发现黄芩苷在口服双黄连粉针剂时的降解速度大于黄芩提取物,这与狄斌等人的研究结果相一致。本项研究发现大鼠灌胃给予双黄连粉针剂后在血浆中检测不到连翘苷,可以检测到微量绿原酸,但更多的是其代谢产物。据国外文献报道,大鼠灌胃绿原酸体内吸收较差,生物利用度不足1%。主要原因是绿原酸很容易受到肠道菌群和肠壁代谢酶的作用,绿原酸的代谢产物主要为咖啡酸、奎尼酸,上述两种产物可继续代谢为马尿酸、安息香酸、阿魏酸和异阿魏