通过对家猫“SILVER”毛色基因位点的测定确定银色性状基因在哺乳动物体内的特定位置

通过对家猫“SILVER”毛色基因位点的测定确定银色性状基因在哺乳动物体内的特定位置摘要：通过测定家猫的SILVER基因位点，找到了哺乳动物中与银色性状或色素减退有关的一个从未报道过的新的基因组位置。存在一个没有证实的、与银色性状最可能基因SILV的连锁，于是用2个银色毛色性状隔离的家系进行基因扫描。遗传连锁图谱确定了D2染色体上一个3.3-Mb（95.87-99.21Mb）的SILVER基因组区域（LOD最大值=10.5,0=0），它与人类10号染色体上118.58-121.85Mb之间的基因区域显示出保守同线性。在家猫中。SILVER位点的突变能抑制毛发色素的生成，但是相比于其他哺乳动物银色变种，其对褐黑素生成的影响比真黑素更为显著。一个新的基因位点SILVER的测定，为确定一个或许有助于阐明尚未弄清的褐黑素生成途径的遗传因子提供了更好的前景，也表明猫基因组计划在提高我们对哺乳动物基本生物历程中一般相关性的了解上有着很好的前景。关键词：毛色，家猫，遗传连锁图谱，褐黑素生成，SILVER据估计，约10000年前（Vigne等，2004）猫在中东（Driscoll等，2007）被驯化，这可能是由于当时形成了原始村庄并且储存了粮食，结果吸引了大量的啮齿动物。与野生型野灰色体表底色相比（图1），家猫的祖先Felissilvestrislybica（非洲野猫），在如今已经很难与带有条纹的普通家养虎斑猫区分开来了。自猫被驯化以来，就开始出现广泛的毛色和花纹变异，包括各种各样的毛色、独特的毛发表型，以及体表图案（条纹、点和斑，包括没有体表图案的“tickedtabby”）。皮毛多样性的进程可以在大多数经历驯化的哺乳动物中观察到，部分原因是家猫不再受自然种群的纯化选择，同时也是由于人类为了得到其所喜欢的颜色和图案而进行有目的的人工选择（Zeuner1963；Trut1999）。图1：野生猫（右）Felissilvestrisly和iCa于家系2生殖的银色雄性欧西猫随着家猫的基因组资源的开发，如综合遗传和辐射杂交图（Menotti-Raymond等，1999，2003，2009；Murphy等，2000，2007；Davis等，2009；Schmidt-Kuntzel等，2009）、1.9x全基因组序列草图（Pontius等,2007）和互动网络浏览器（Pontius和O'Brien2007），一些能引起表型变异的基因可以在分子遗传水平上测定或描述，如黑色基因（Eizirik等，2003）、棕色基因和肉桂色基因（SchmidtKuntzel等，2005）、淡色基因（Ishida等，2006）、暹罗和缅甸表型，白化基因（Lyons等，2005；Imes等，2006）、长发基因（Drogemuller等，2007；Kehler等,2007）和橙色基因（Schmidt-Kuntzel等，2009）。猫显示了还没有被绘制或描述的其他颜色变种，包括一个银色毛发变种（图1），这是由于被称为“抑制”位点上的常染色体显性遗传（Vella等，1999）。在家猫中，抑制位点或SILVER位点上的突变可以抑制毛发中色素的产生，但相比于其他哺乳动物银色变种，其对褐黑素生成的影响比真黑素更为显著（Vella等，1999）。由于真黑素向褐黑素生成的转变（Eizirik等,2003），可以在野生型猫身上看到特征性的“黄橙色”深浅条纹带，而这些在银色猫中几乎是白色或无色的。此外，银色家猫的毛发显示银色（接近无色）的底色，在其头发末端（图2）伴有可视的正常色素沉着（包括取决于其他基因位点的真黑素）。银色猫中显著的表型是“烟雾色”，这源于银色基因对对非野灰色（带黑色的，即黑色）底色的影响。与银色猫的毛发相比（Vella等，1999），这些猫的披毛显示出银白的底色，并带有伸长的黑色末端（图2）。SILVER并不能阻断褐黑素的合成，橙色，银色的虎斑猫可以证明这一点。然而，橙色色素沉着的颜色与橙色，非银色猫中观察到的颜色略有不同，其没有可在典型橙色猫中看到的暖色的棕色色调（PfluegerS,个人通讯）。图2：展示毛发，来自于家猫银色（A）、烟雾色（B）、带黑色（C）个体Dunn和Thigpen（1930）首次在小鼠中描述了SILVER基因位点。此后，产生银色性状的基因位点或色素减退表型开始在许多生物体中报道，其中包括马，狗，牛，小鼠，鸟，鸡和斑马鱼（Martinez-Esparza等，1999；Kerje等，2004；Schonthaler等，2005；Brunberg等，2006；Clark等，2006；Kuhn和Weikard，2007,Reissmann等，2007）。涉及这些“银色”表型的基因是SILV位点（也称为“银色同源物”或PMEL17），其在黑色素小体形成的早期阶段能产生一种重要的蛋白质产物（Kobayashi等，1994；Zhou等，1994；Berson等，2001）。其遗传模式是典型的常染色体显性。在斑马鱼和狗中，视觉缺陷和色素减退与SILV位点上的突变相关（Schonthaler等，2005；Clark，2006）。携带merle突变的狗，其特征是SILV中插入一个短散在元件，表现出与正常色斑并排的淡色斑块，并且还有听觉异常（Clark等，2006）。在人类中，没有报道与位于12q13-q14上SILV基因的相关突变，猫中也没有报道与银色表型有关的病理现象。哺乳动物中已有其他基因参与色素减退的报道（Mariat等，2003；Cook等，2008）。我们在这里报道家猫SILVER位点的测定，以此鉴定哺乳动物中银色/色素沉着基因的一个新位点。材料与方法实验动物使用了两个家系（图3）。家系一是由国立卫生研究院动物中心（NIHAC）开发的。该系由纯种银色雄性埃及猫（EgyptianMau）与三只无关联的非银色杂种（他们不属于一个品种）雌猫杂交所形成。它们产下了7个后代，其中5个显示银色，表明父本是SILVER杂合子。这5名杂交1代个体（4雌1雄）与非银色的杂种猫回交，产下23只第三代猫，其中19只明确地表现出SILVER位点的表型。总体而言，杂交1代和回交个体呈现出的银色（n=14）与非银色伍=12）表型近似1：1。另一个分离出银色基因的家系（以下称为“家系二”）是由一个合作的猫种养殖者提供的。将一只纯种的银色雄性欧西猫（Ocicat）与两只雌猫交配，产下12只后代，其中5只为银色，7只为非银色。图3：用于测定家猫SILVER位点的家系；家系1（左）；家系2（右）巴SILVER杂合雄性；^SILVER杂合雌性DNA提取采集家系一所有个体的血液样本，作为一个标准DNA来源；此外，根据NIHAC动物实验协议从每只动物收集皮肤活组织检查，并建立细胞系作为高质量基因组材料的来源。家系二中个体提供口腔黏膜拭子样本。按照制造商提供的方法，使用血液DNA中提或小提试剂盒（凯杰公司生产）分别从血液和口腔黏膜样品中提取全血和成纤维细胞系中的DNA。用HoeferDNA定量200荧光分光光度计定量DNA（AmershamBiosciences）。每个样品的比例用无菌蒸馏水稀释到2.5ng/卩L的标准浓度（QualityBiological）。微卫星的聚和酶链反应扩增与基因分型利用沿着猫基因组的特定区间所选择的微卫星进行基因组扫描（Murphy等,2007；Menotti-Raymond等，2009）。使用如以前所述的touchdownPCR程序（Menotti-Raymond等，2005。进行微卫星的聚合酶链反应（PCR。扩增。样品的电泳和基因分型，以及孟德尔遗传检验，如以前所述进行（Ishida等，2006）。精细定位SILVER的附加微卫星的研制在使用先前发表的猫微卫星建立SILVER与一个基因组区域的连锁后，从猫1.9x全基因组序列中（Pontius等人，2007）选取来自可能片段区间的附加标记。根据其在猫D2染色体上的位置选择微卫星标记，并从加菲猫（GARFIELD）基因组浏览器（http：//lgd.abcc.ncifcrf.vvv/cgi-bin/gbrowse/cat/）中选取标记（Pontius和O'Brien2007）。这些包含SILVER位点在表1中用前缀“D2”表示。新基因位点的引物（补充材料，见附录1）是用Primer3（http：//frodo.wi./cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）设计的（Rozen和Skaletsky，2000），包括一个用荧光标记的PCR产物M13尾巴（Boutin-Ganache等，2001）。遗传连锁图谱按照Superlink的方法（Fishelson和Geiger， 2002，2004）计算出单个标记的连锁系数（LOD）,结果正如Ishida等（2006）和Kehler等（2007年）所描述的那样。由于两个家系分别由单个雄性所建立（一只是纯种的埃及猫，另一只是纯种的欧西猫），我们把数据既作为一个单一的家系又作为2个独立的家系来分析。两个家系中的相同基因组区域都绘制出SILVER位点（数据未显示）。结果与分析我们通过对与SILVER最可能位点紧密相连的微卫星标记（FCA867，在B4染色体102.1Mb上）的基因分型开始我们的分析，该位点是猫B4染色体上96.37-96.39Mb的SILV基因（Murphy等,2007）FCA867和SILVER（LOD=-5.7,0=0）之间的连锁关系缺乏论证,LOD值低于常规使用的值为-2的排除标准（Ott,1991），该连锁可导致在猫基因组的特定区间所选择的微卫星启动基因组扫描（Murphy等，2007；Menotti-Raymond等，2009）。先在2个家系中对96个微卫星进行基因分型，再在猫D2染色体用微卫星FCA955（LOD=2.79,0=0.2）检测是否有连锁关系。在FCA955附近使用7个以前发表的微卫星标记和从猫基因组互动浏览器GARFIELD（http：///cgi-bin/gbrowse/cat）中选择的另外11个微卫星标记进行精细的遗传图绘制（Pontius和O'Brien2,007）（补充材料，见附录1）。将SILVER可能区域确定在一个3.3-Mb区域，该区域在D2染色体上FCA1240标记（95.87Mb）和D2_99.21标记（99.21Mb）之间（LOD

最大值=10.5,0=0（表1）,它与人类10号染色体上118.58-121.85Mb之间的基因区域显示出保守同线性。根据人类基因组（版本36）（/projects/mapview/stats/BuildStats.cgi？taxid59606&build536&ver53）,该区域包括大约17个基因组（补充材料，附录2）这些基因不同于之前所知的其他物种的银色毛发、淡色毛发或色素沉着基因。表1用于测定SILVER的微卫星标记MarkeraLODQCatChrD2DogChr28bHumanChr10cFCA9552.80.286,022,42621,788,479108,516,870FCA12392.00.186,789,15722,486,644109,388,134FCA12413.70.291,583,98526,143,901113,744,643D2_593,358,57928,191,399116,105,982D2_93,900,28428,668,678116,660,785D2_94,524,84429,257,166117,375,668D2_595,192,20029,813,138117,921,715FCA9545.80.0595,823,88830,338,383118,536,757FCA12407.40.0595,875,32530,384,390118,588,972D2_96.110.5096,114,95630,595,675118,846,522D2_96.98.1096,990,09931,332,116119,656,273D2_98.110.2098,100,27432,256,893120,742,485D2_98.67.8098,601,08332,659,233121,227,619D2_99.165.3099,167,85133,131,599121,797,461D2_599,219,02533,175,512121,850,894D2_99.276.70.0599,275,74733,215,309121,887,548F415.10.199,706,53433,563,419122,318,976FCA12421.90.1105,677,50138,419,330127,982,490FCA12430.60.3107,394,18339,793,387129,659,013a粗体的标记是之前已发表的，其他标记是从GARFIELD基因组浏览器中选取的，如材料与方法所述b由Blat基因检索的400bp猫基因组DNA，位于2005年5月组成的狗染色体两端，使用UCSC基因组浏览器预估而来。c2006年3月组成的人类染色体位点，使用UCSC基因组浏览器将狗染色体位点转换而来。在猫SILVER基因中一个有吸引力的可能基因是SLC18A2，它是溶质载体家族18的成员。SLC18A2在人和啮齿动物模型中被描述为囊状单胺转运蛋白，它将细胞质内一元胺累积成囊泡（Peter等，1995）。相关基因（SLC45A和SLC36A1）的突变可导致马奶油色和香槟色毛色的色素沉着（Mariat等，2003；Cook等，2008）、小鼠白血病（uw）表型色素沉着减少（Lehman等，2000）、和欧洲人苍