微柱凝胶技术在输血前检测中的应用及相关

微柱凝胶技术在输血前检测中的应用及相关

长春博迅生物李凌波医学博士副研究员

E-mail:lilingbo@

2010年12月

Tel柱凝胶技术在血型鉴定及不完全抗体检测中的应用

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1990年，法国人Y.Lapierre发表文章*介绍了一项免疫学检测新技术：将抗原抗体反应与凝胶分子筛技术相结合，即微柱凝胶免疫实验。该技术的本质是血凝试验，即红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的免疫凝集反应。

*

LapierreY,RigalD,AdamJ,etal.Thegeltest:anewwaytodetectedcellantigen-antibodyreactions[J].Transfusion,1990;30(2):109-113.

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微柱凝胶免疫实验试剂依其胶中有无抗体及抗体性质分为:

中性胶试剂:微柱腔及胶中不含特异性抗体，也不含抗人球蛋白。特异性胶试剂:微柱腔及胶中含有特异性抗体，如人ABO血型单克隆抗体等。

抗人球蛋白胶试剂:微柱腔及胶中仅含有抗人球蛋白，不含特异性

抗体。

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R.R.A.Coombs

(January9,1921-January25,2006)1945年，剑桥大学病理学部R.R.A.Coombs发明了抗人球蛋白试验，半个多世纪以来，该试验始终是最经典、最准确的检测IgG类不完全抗体的方法，但因其操作繁琐，反应时间较长，不适用于大批量样本的检测，始终未能在临床常规应用。

Tel统的试管Coombs试验主要问题是操作繁琐，需多次洗涤，加入红细胞抗原和血清标本后，孵育，至少三遍洗涤，再加入抗球蛋白试剂，以避免其被血清中其他非特异性球蛋白中和，抗球蛋白试剂才能真正连结红细胞膜上的不完全抗体，使之出现凝集。

Tel完全抗体与相应抗原红细胞，在含有抗人球蛋白凝胶介质中进行的抗人球蛋白试验称之为微柱凝胶抗人球蛋白试验，即微柱凝胶Coombs试验(MG-Coombs‘T)。MG-Coombs‘T孵育后的红细胞不需三洗，且孵育时间只需15分钟，尤其提高了免疫凝集试验的敏感性，使其能更广泛地应用在临床免疫检验中。

TelG-Coombs’T简化洗涤步骤的根本原因:

由于加入的人血清和含抗球蛋白试剂的凝胶长时间处于两相状况，相互不扩散，即凝胶中抗球蛋白试剂并不被人血清中的球蛋白中和及消耗；并且红细胞和血清成分以不同的速度通过微柱(重力加速度不同)，从而也消除了血清中未结合的球蛋白中和AHG的可能性，这就是MG-Coombs’T可以简化洗涤步骤的原因。

Tel红细胞沉降需要的离心力一般是小于100g,而抗体等蛋白质复合物分子沉降分离需要的离心力至少是3000g。因此微柱凝胶免疫分析技术中的离心力只能使未结合红细胞下降分离到微柱腔尖底部，而却不能使血清蛋白、抗人球蛋白以及可溶性抗原抗体复合物达到同样效果。抗人球蛋白-特异性抗体-红细胞颗粒性免疫复合物在离心下降分离过程中，在通过微柱中液体介质和凝胶两相之结合区时，阻力增大，细胞间距离缩小，排除其间可溶性复合物的位阻现象，有利于红细胞上抗人球的桥连，从而增加了反应的敏感性。

Tel柱凝胶免疫检测方法的历史1984-发明建立(Dr.Y.Lapierre,Lyon,France)1988-

出现商品化试剂盒1990-Lapierre于Transfusion杂志发表文章介绍该技术1994-获美国FDA认证1996-美国AABB《输血技术手册》将该方法列入血型检测常规技术，同年，长春生物所成功研发出该技术，制备出系列试剂盒、离心机及孵育器等。目前该方法在发达国家已成为红细胞血型血清学临床检测常规技术。

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凝胶检测技术已改变了免疫血液学检测的传统实验,并打开了新技术应用的大门

——Y.Lapierre从理论上讲,颗粒性凝集只要指示(细胞)颗粒与凝胶颗粒相匹配,就可以在凝胶检测系统中应用,因其本质上是凝胶的过滤作用。这就使得该技术不仅仅应用于红细胞抗原抗体检测，而成为了一种还能够应用于血液细胞、病源微生物、神经内分泌因子、肿瘤标志物等抗原抗体检测的临床免疫学新方法。

TeloxSang1997;73:246–251

TeloxSang1997;73:246–251

Tel于在微柱凝胶法因为抗原抗体量是恒定的，操作标准化，并采取了特殊的分子筛技术，所以检测到抗原抗体弱反应的强度高于传统的试管法1,2，具有独特的优势，目前国内也已逐步应用于临床。还有研究显示3微柱凝胶法对混合凝集(即在一个反应体系中同时出现阴性、阳性两种反应结果)的呈现在发现ABO血型亚型方面具有明显的技术优势(许多亚型红细胞在与标准血清反应呈现混合视野凝集，在传统的玻片法和试管法中不便于发现)。1郭博,马华,李兴武,等.手工微柱凝胶免疫检验法在ABO、RhD血型抗原鉴定中的应用[J].蚌埠医学院学报,2005,30(1):72-73.2周小玉,许进明,华岚,等.微柱凝胶法鉴定ABO血型正反定型不一致原因分析[J].临床输血与检验,2007,9(4):366-367.3于洋,冯倩,林子林,等.全自动微柱凝胶技术在ABO、RhD血型鉴定中的应用研究[J].北京医学,2008,30(3):165-167.

TelBO疑难血型中亚型的鉴定:ABO血型亚型是造成ABO血型疑难鉴定的最主要原因之一，有报道*指出由亚型造成血型定型错误占到16%。常见ABO疑难血型正反定型不符的原因较多，其中亚型也是最难确认的。ABO亚型的正反定型主要存在两种情况，在正定型由于亚型红细胞携带的A或B抗原数量少，常规血清学方法正定型检测范围内与抗-A或抗-B反应弱，甚至不发生凝集，因而往往使弱A(或弱B)错判为O型;另外，A2等亚型常含有针对自身抗原表位缺失部分(如A2含有的抗-A1，参照D抗原表位不完全型)甚至是针对自身抗原(如Ax含有的抗-A)的意外抗体，造成反定型鉴定错误。在A或B亚型，若将弱A或弱B的红细胞输给O型受血者或额外出现的抗体在37℃反应，就会引起溶血性输血反应。

*吴敏慧,刘毅,刘洪莉,等.ABO血型正反定型不符确认试验结果分析[J].临床输血与检验,2005,7(3):198-199.

Tel亚型：主要有A1、A2两种亚型，A1比A2多4倍，A1型的红细胞有A及A1两种抗原，A2型的红细胞只有A抗原。A的弱亚型：比A2亚型还弱，其特征是随着红细胞上A抗原位点数目的减少，抗原性逐渐减弱，H抗原活性反向增强。弱A亚型包括A3、Ax、Am、Ay、Ael等，其红细胞上的H物质量正常，或多于正常。

Tel亚型：发现了B3、Bm、Bel等弱B亚型。B亚型的鉴定可参照

A亚型。基于ABO亚型的血清学特点，在实际工作中正反定型不符已成为ABO亚型分类的主要依据之一，可利用相比常规方法更敏感的微柱凝胶法结合血清学技术对其筛选鉴别并正确鉴定血型，从而提高血型定型的准确率，有效减少或预防临床输血反应的发生。

Tel：实验中一例A2B亚型的鉴定：临床标本，姓名：张××

，标本离心分离血浆，常规操作，制备0.8%、4%红细胞悬液。对标本进行正反定型，博迅定型试剂卡批号：20081006，反定型试剂批号：20090602，结果如下：

正定型反定型抗-A抗-B抗-DA1Bc3+3+4+4+W－阳性4+W，存在混合凝集

应用微柱凝胶技术结合常规血清学方法对ABO亚型的鉴定

Tel本正定显示为AB型，反定显示为B型，反定该标本血清(血浆)与反定型A1细胞呈现4+W的反应格局(存在混合凝集)，正反定型不符。该结果反定用卡复试一次，结果一致，试管法复试4+W(未发现混合凝集)。采取措施如下：(1)用自身血清、红细胞做反定型对照，检验自身完全抗体。(2)用O型红细胞做反定型对照，确认是否存在ABO系统以外完全抗体。

结果为：反定型O1细胞O2细胞自身细胞－－－

Tel用O1、O2两种细胞及自身红细胞做反定型对照，结果皆阴性。证实无自身完全抗体，无ABO系统外完全抗体。用博迅卡、试管法各复试一次，结果一致。(3)对该标本进行直抗、抗筛实验，直抗用卡法、试管法两种方法，抗筛应用卡法、聚凝胺法、试管法三种方法。结果为：直抗两种方法皆阴性，抗筛三种方法皆阴性(筛检细胞批号:090601)。(4)应用B型、AB型血辨分别与该标本进行交叉配血。B型与标本交叉配血分别应用卡法、聚凝胺法、试管法，三种方法主侧阴性，次侧皆阳性，B型供血者血清亦进行抗筛试验结果全阴性。

标本红细胞与B型血辫血清分别应用卡法、聚凝胺法、试管法交叉配血(次侧)结果：卡法:4+W聚凝胺:3+W试管法:4+W

Tel标本与AB型血辨卡法交叉配血结果:主侧有微弱凝集，凝集强度1+W

Tel虑到该标本正反定型不符，正定为AB型(与抗-A、抗-B反应强度为3+,可排除弱亚型)，反定为B型(4+W,存在混合凝集)，反定自身对照、O细胞对照皆阴性；B型交叉配血次侧不符(4+W)，且直抗阴性；AB型交叉配血主侧有微弱凝集，且抗筛阴性。由于反定型与A1细胞反应阳性，初步判断该标本为AB型(出现了针对自身抗原缺失部分的意外抗体)，其中A抗原为亚型，用抗-A1试剂验证：将该标本红细胞悬液与抗-A1试剂在含中性胶的卡中反应，结果阴性，且标本与抗-A阳性，说明该红细胞上仅有A抗原，无A1抗原，判断该抗原为A2亚型，即标本为A2B。

Tel多种不同技术可用来检测红细胞上的抗原数量，这其中包括使用标记抗体或外源性凝集素的放射免疫法。在1976年，Rochant等发现，多数A2个体的红细胞与荧光标记的双花扁豆凝集素反应表现很弱的荧光，但少数细胞表现很强的荧光；相反地，绝大多数A1个体的红细胞表现很强的荧光信号，仅极少数的细胞表现弱的荧光信号，这可以解释当使用抗-A1试剂时出现的混合视野外观*。在本例，反定型中标本血清里额外的抗体与A1型红细胞反应，出现了阳性4+W，同时伴有阴性反应的混合凝集，说明该抗体特异性的与A1抗原反应，但也存在着同以上表述类似的反应检测体系捕捉不到的微弱信号，这也就印证了Rochant等人的研究结论，并且为本例样本的鉴定提供了一个佐证。

*RochantH,TonthatH,HenriA,etal.Abnormaldistributionof

erythrocytesA1antigensinpreleukemiaasdemonstratedbyanimmunonuorescencetechniclue.BloodCells,1976,2:237-255.

Tel1%-2%的A2型人和22%-26%A2B型人的血清中可能产生抗-A1(在本例即这种情况)，室温下该抗-A1只凝集A1型红细胞(本例反定型)，不凝集A2型红细胞(本例用抗-A1试剂鉴定出A2型红细胞)。在交叉配血试验中(37℃)，抗-A1能引起一部分A型献血者红细胞不相容。如果抗体反应只发生在室温下，一般不会缩短输入体内红细胞的存活期。那么在本例标本血清与AB型红细胞进行交叉主侧配血出现1+W凝集，即标本血清抗体在37℃出现了反应，该抗-A1抗体应定性为临床有意义抗体，则应该给予交叉配血相容的血，即A2B型血，或成份输血输入O型洗涤红细胞。以保证临床用血安全。

Tel血前抗体筛查实验的必要性1.检测程序：血型检测不完全抗体的检测交叉配血2.抗体性质：临床有意义抗体和无意义抗体完全抗体和不完全抗体3.检测技术和方法：对完全抗体的检测对不完全抗体的检测（或应用完全抗体的检测、应用不完全抗体的检测）输血前血型血清学检测要点血型相容性试验可以高度概括为“3项检测程序，2类抗体检测技术，1个明确目的”。抗原定型、抗体检测和交叉配血3项程序是分别进行，但实质都是检测血型抗原抗体。ABO血型以外的同种异型抗体称之不规则抗体，其检测分为筛检试验和确定性检测两步检测程序，完全抗体和不完全抗体检测两类试验技术。检测完全抗体以盐水血凝试验为代表；检测不完全抗体分为筛检和确定性检测技术，木瓜酶、菠萝酶、PEG、聚凝胺等都是抗体筛检技术，抗球蛋白试验是确定性检测技术。目前抗球蛋白试验技术已能够简便、确定性地临床常规检测不完全抗体，故临床常规应用筛检试验技术的必要性越来越小。一个目的安全输血被检者血清中存在ABO系统以外的特异性同种抗体(IgM/IgG)，血型定型时出现正反定不符。例：临床标本，姓名：魏××

，标本离心分离血浆，常规操作，制备0.8%、4%红细胞悬液。对标本进行正反定型，结果如下：

正定型反定型抗-A抗-B抗-DAc

Bc

－4+4+4+1+P标本正定显示为B型，反定显示为O型，反定该标本血清(血浆)与反定型B细胞呈现1+P的反应格局，正反定型不符。该结