高效液相色谱法测定柴胡中黄酮类化合物

高效液相色谱法测定柴胡中黄酮类化合物

柴胡是伞科植物，主要是根和草本植物。它是中国四大缺陷药物之一。它又苦又平。具有内外和解、舒肺解郁、升福阳气的功能。主要用于散热、胸闷、胸痛、月经不调等疾病。柴胡的有效成分为柴胡醇、酒精、乙醇（柴胡醇、丁香酚等）、脂肪油（油酸、亚麻油酸、棕榈酸、硬脂酸等）和多糖等。此外，它还包括氨基酸、黄酮类、氨基酸、葡萄糖、氨基酸等。黄酮类化合物对人体肿瘤、老人和心血管疾病的治疗和预防具有重要意义。例如，类黄酮类化合物具有抗逆性、抗突变、减少毛细血管异常渗透性和脆弱性等作用。它被用来治疗各种由血管干燥引起的出血疾病。它也可以用来治疗高血压和年老炎症性疾病。类黄酮类化合物的选择性抗剂剂，能降低血管的渗透性和脆弱性，抑制血小板聚集，防止血栓形成。这是治疗闭塞性脑病的常用药物，具有清热解毒、扩张心脑血管、改善体内微循环等作用。黄酮类化合物具有代表性。据研究，它具有抗自由基、氧化、抗癌、糖尿病并发症和其他生物活性和药理。它对呼吸道疾病，尤其是哮喘和支气管炎疾病有很好的治疗效果。目前已报道的测定黄酮类药物的方法很多,主要有化学发光分析法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、分光光度法、等吸收紫外光度法等,但一般都是分析一种或两种黄酮类成分,同时分析芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素四种成分还未见报道.本文采用反相高效液相色谱法,同时分离和测定了柴胡中芦丁、曲克芦丁、黄芩苷和槲皮素四种黄酮类成分的含量.操作方法简单易行,结果准确可靠,为柴胡中黄酮类成分的含量测定和质量监控提供了科学依据.1实验部分1.1药品、化学品和相对品日本岛津(SHIMADZU)LC-10A高效液相色谱仪系统;CLASS-VP色谱工作站;Milli-Q纯水器(Millipore公司);HANGPINGSB2200电子天平(上海天平仪器厂);0.45μm微孔过滤器;高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂).芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100080-200306);曲克芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100416-200503);黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110715-200514);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100081-200406);柴胡(产地:河北祁州,生产厂家:河北安国兴旺制药饮片公司).甲醇、乙腈为色谱纯,水为Milli-Q纯水器处理的超纯水,其它试剂为分析纯.1.2方法和结果1.2.1标准溶液的配制称取芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素对照品各10mg于四支比色管中,用甲醇溶解并定容至10mL,配制成浓度为1mg·mL-1的标准溶液.取上述标准溶液各100μL于一支10mL比色管中,然后用甲醇定容至刻度,配制成浓度为0.01mg·mL-1的标准混合溶液.测定时取上述标准溶液稀释成适宜度的标准溶液.1.2.2乙醇的提取柴胡用粉碎机粉碎后,过4号筛,称取5g置于圆底烧瓶中,加70mL乙醇和30L水回流2.5h.待冷却、过滤后,于78℃蒸馏回收乙醇.浸膏用水饱和的乙酸乙酯萃取3次(20:15:10),合并乙酸乙酯层,于77℃蒸馏回收乙酸乙酯.残渣用甲醇定容至10mL比色管中,摇匀,过滤,弃去初滤液,取续滤液再用0.45μm微孔滤膜过滤即得.1.2.3保护柱和流动相柱色谱柱:Shim-packVP-ODS柱(150mm×4.6mm,5μm);保护柱:Shim-packGVP-ODS柱(4.6mm×10mm,5μm);流动相:0.5%的磷酸溶液-甲醇(63:37);流速:0.8mL·min-1;检测波长:333nm;进样量:20μL;柱温:40℃.对照品和样品的色谱图见图1.1.2.4标准工作曲线和检出限取适宜浓度的标准溶液,用甲醇稀释并定容于10mL比色管中,配制浓度分别为10μg·mL-1,5μg·mL-1,2.5μg·mL-1和1μg·mL-14个水平黄酮类药物的标准混合液,每个溶液分别进样3次,以峰面积对浓度作工作曲线,用稀释法测定四种黄酮类药物的检出限.四种黄酮类药物的标准工作曲线线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限列于表1,其中X表示黄酮类药物的浓度,Y表示黄酮类药物的峰面积.1.2.5稳定性试验称取柴胡样品5g,按1.1.2法操作制备供试品溶液,分别在1,2,3,4d于上述色谱条件下测定,以峰面积计算芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素的RSD分别为2.1%,2.2%,3.5%,4.7%.结果显示供试品溶液在4d内稳定.1.2.6rsd的测定称取柴胡样品5g共6份,按1.1.2法操作制备供试品溶液,于上述色谱条件下测定,以峰面积计算芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素的RSD分别为1.1%,3.5%,2.7%,4.3%.1.2.7进样检测取上述对照品溶液20μL,按照上述色谱条件重复进样6次,以峰面积计算芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素的RSD分别为1.6%,2.1%,3.0%,1.1%..1.2.8加标回收试验取已知含量的柴胡供试品溶液各1mL分别于三支10mL比色管中,再分别加入4μL,6μL,8μL的1mg·mL-1芦丁、曲克芦丁、黄芩苷,(槲皮素因含量较高,标准品加入量增加10倍),配制成4μg·mL-1,6μg·mL-1,8μg·mL-1的加标溶液.在最佳色谱条件下进样,做加标回收试验,回收率见表2.1.2.9样品测定结果将柴胡供试品溶液直接进样分析,发现柴胡中槲皮素含量较高,故采用单点校正法定量,其它三种组分含量较低,采用标准加入法定量,样品测定结果见表3.2讨论2.1流动相的可以添加量考察采用甲醇和水、甲醇和磷酸或磷酸盐、乙腈和磷酸、四氢呋喃(THF)和磷酸五种不同体系作为流动相时芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素四种黄酮成分的分离情况,结果表明:采用CH3OH-KH2PO4(40:60)为流动相时,黄芩苷和槲皮素拖尾比较严重;选择H3PO4-CH3CN(54:46)为流动相时,各组分分离情况不佳;当用H3PO4-THF(67:33)为流动相时,虽然峰形比较好,但芦丁和曲克芦丁分不开;选择CH3OH-H2O(37:63)为流动相时柱压很高;而选用CH3OH-H3PO4(37:63)时,峰形好又可以使四个组分在35min内达到完全分离,而且柱压也不高.综合考虑以上因素,最后选CH3OH-H3PO4(37:63)为分离四种黄酮类药物的流动相.2.2甲醇比例的影响考察流动相中甲醇比例不同时,对四种黄酮组分保留时间的影响.以混合标准溶液进样分析,结果显示:随着甲醇比例增加,流动相的极性增强,各组分的保留时间相应缩短.当甲醇比例超过37%时,各峰的峰形不太好;当甲醇的比例小于37%时,流动相极性减弱,各组分的保留时间相应增加,导致分析时间大大延长,且柱压增大;当甲醇比例为37%时,在35min内四种组分达到基线分离.2.3最大吸收的测定波长取20μL的0.01mg·mL-1标准混合溶液进样,由紫外光谱可知:芦丁在350nm和260nm时有最大吸收;曲克芦丁在354nm和255nm时有最大吸收;黄芩苷在318nm和274nm处有最大吸收;槲皮素在370nm和254nm处有最大吸收.结果显示:当检测波长