曲克芦丁中羟乙基芦丁衍生物的测定

曲克芦丁中羟乙基芦丁衍生物的测定

特洛伊木马是羟乙基化半合成的产物。它可以降低毛细管的渗透性和脆弱性，抑制血小板聚集，防止血栓形成。这是治疗闭塞性脑病的常用药物。由于芦丁有四个酚羟基,经羟乙基化后可形成十余种羟乙基和位置不同的衍生物。各衍生物间性质接近,难以分离、纯化。目前生产和使用的曲克芦丁为以三羟乙基芦丁[3′,4′,7-三(2-羟基乙基)芦丁]为主的羟乙基芦丁混合物,其它成份有单羟乙基芦丁、二羟乙基芦丁、三羟乙基芦丁异构体和四羟乙基芦丁等。以上成份作为其它羟乙基芦丁衍生物,在药品质量标准中需要加以控制。曲克芦丁的分离测定方法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法。在四川、山东等多个省、区的质量标准中收载有曲克芦丁,但其它羟乙基芦丁衍生物的检查仅山东省药品质量标准中收载。德国药典[DAB(1997)]采用HPLC法检查曲克芦丁中其它羟乙基芦丁衍生物,采用填料粒度为4μm的ODS柱,流动相为乙腈-0.1mol·L-1的磷酸二氢钠(2∶8),紫外350nm检测。填料粒径为4μm的色谱柱价格昂贵。经试验,改用常用的5μm填料的色谱柱,峰明显扩宽,分离度变差。采用高效液相色谱法检查曲克芦丁中其它羟乙基芦丁衍生物,国内未见报道。为控制曲克芦丁中其它羟乙基芦丁衍生物的量,建立了检查曲克芦丁原料药中其它羟乙基芦丁衍生物的高效液相色谱法。本法不需使用特殊的色谱柱,方法简便、精密度好,适用于常规分析。1实验部分1.1色谱数据处理日本岛津LC-10A液相色谱仪,SPD-10A紫外-可见检测器,C-R7A色谱数据处理机。乙腈为色谱级;四氢呋喃为分析纯,经重蒸处理;水为重蒸馏水;其它试剂均为分析纯。曲克芦丁原料药(四川协力制药有限公司)。1.2方法和结果1.2.1不同杂质峰的确定用TLC法制备部分杂质的对照品。参照DAB(1997)TLC法鉴别中各杂质的Rf值,收集有关斑点,以甲醇-水(1∶1)洗脱,采用相同的色谱条件分析,确定保留时间6.2min的峰为四羟乙基芦丁,主峰三羟乙基芦丁的保留时间为17.2min,保留时间19.3min和20.7min的峰为三羟乙基芦丁异构体,其它杂质峰尚待确定。1.2.2系统的适用性1.2.3试验溶液的制备1.2.4精密度测试1.2.5分离效果的检验由表2、图2可以看出,在不同的色谱柱上,均可得到满意的分离效果。在选定的色谱条件下,取供试品溶液4、6、8、10μl进样,测定峰面积值,按峰面积归一化法计算各组份的相对含量(表3)。1.2.6样品的质量分析2色谱柱的确定和色谱图的设置2.1由于测定组份的水溶性很强,于流动相中加入适当比例四氢呋喃,可增强组份在固定相上的保留,有利于三羟乙基芦丁和其后相关物质峰的分离;三羟乙基芦丁及相关物质有酚羟基,具有一定酸性,在流动相中加入一定量的磷酸二氢钠,并调至酸性,有利于改善峰形,提高柱效。用二极管阵列检测器(DAD)检测,测定各组份的紫外吸收光谱,结果发现,三羟乙基芦丁及其它羟乙基芦丁衍生物在紫外254nm和350nm处均有最大吸收,采用350nm检测可减少其它物质的干扰。2.2经试验,进样量在2～10μg范围内,三羟乙基芦丁及其它羟乙基芦丁衍生物的相对含量的精密度好,三羟乙基芦丁峰面积与进样量呈良好线性关系,回归方程为:A=0.2031x-0.0598,r=0.9999。因此,以上色谱条件也可用于曲克芦丁原料药的含量测定。2.3三羟乙基芦丁与其后杂质峰的分离效果与保留时间有关,保留时间过短,分离变差。因此,采用不同的色谱柱测定时,适当调整流速,使主峰的保留时间在17～20分钟。经反复试验后选定的色谱条件为:日本岛津Shim-packCLC-ODS柱(150mm×6.0mm,5μm),预柱为PhenomenexODSGuardCartridgeSystem(4.0mm×3.0mm);流动相为乙腈-四氢呋喃-0.05mol·L-1磷酸二氢钠溶液(5∶8∶87),用磷酸调pH4.0,调整流速,使曲克芦丁峰的保留时间为17～20min,紫外350nm检测。在此条件下曲克芦丁原料药的色谱图见图1。按曲克芦丁峰计算,柱效为7.5×103;曲克芦丁与其前杂质峰的分离度为3.4,与其后杂质峰的分离度为1.5,在选定的条件下,曲克芦丁和有关物质的峰可以完全分离。精密称取供试品约50mg,精密加入流动相50ml,振摇使溶解,溶液如不澄清,滤过,取续滤液备用。取供试品溶液10μl,重复进样六次,测定三羟乙基芦丁、四羟乙基芦丁和其它三个主要羟乙基芦丁衍生物的峰面积,峰面积的RSD为重复进样的精密度;在同一天内于0、2、4、6、8h进样一次,峰面积值的RSD为日内精密度(表1)。为考察色谱柱对分离的影响,在选定的流动相下,使用三种不同的色谱柱:岛津ShimpackCLC-ODS柱(150mm×6.0mm,id),流速为1.0ml·min-1;WatersSpherisorbS5ODS柱(250mm×4.6mm,id),流速为0.8ml·min-1;Luna5μC18柱(150mm×4.6mm,id),流速为0.6ml·min-1,分别测定同一批样品,色谱图见图2,测定结果见表2。精密称取曲克芦丁原料药50.0mg,精密加入