lc-msms法同时测定小鼠血浆中的cn486、芦丁和曲克芦丁

lc-msms法同时测定小鼠血浆中的cn486、芦丁和曲克芦丁

黄酮是植物中的一种多酚类化合物，通常以糖的形式连接到一些物质。黄酮类化合物抗氧化、促进血液循环、抗病毒等方面的活性已久为人知,被认为是低毒并有保健功能的一类天然化合物。但由于黄酮苷结构复杂、代谢广泛给其药代动力学研究带来很大难度,甚至成为制约其药用开发的瓶颈。在学术界有关黄酮苷的体内吸收问题多年来也一直是争论的焦点。黄酮类化合物从化学结构上看有如下特点:以槲皮素为基本骨架的黄酮所占比例最多,而槲皮素多被糖基化且糖基化的位置多发生于3位的羟基,75%的黄酮醇苷在3位都含有糖链。因此,开展槲皮素-3-O-黄酮苷的研究对于黄酮类化合物研究具有很好的典范作用。槲皮素-3-O-芹菜糖-(1→2)-鼠李糖-(1→6)-葡萄糖苷,代号CTN986,是从无毒棉花籽中分离得到具有抗抑郁活性的槲皮素-3-O-黄酮三糖苷。芦丁(rutin)是CTN986脱去一分子芹菜糖后的槲皮素-3-O-黄酮二糖苷,具有维持血管弹性、增强毛细血管抵抗力、降低血管脆性和通透性的作用,常用于防治高血压病的辅助治疗。曲克芦丁(troxerutin)是为改善芦丁的生物利用度而将芦丁羟乙基化制成的半合成黄酮类化合物,是商品药维脑路通的主要成分,具有抑制血小板聚集,防止血栓形成,同时增加血中氧饱和度,改善微循环的作用。目前,分别测定血浆中CTN986、芦丁和曲克芦丁的分析方法已有文献报道,但同时测定三者的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法尚未见报道。本实验建立了同时测定小鼠血浆中三者浓度的LC-MS/MS法,并应用此法比较了小鼠口服和静注上述3个化合物后的药动学特征,以及P-gp抑制剂维拉帕米对三者在小鼠体内药动学行为的影响。1材料和方法1.1仪器和色谱条件CTN986和CTN987(内标)由军事医学科学院毒物药物研究所植物化学研究室提供,芦丁购自AcrosOrganics公司,曲克芦丁购自上海阿拉丁试剂有限公司,结构式见图1。甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司,异丙醇(色谱纯)购自美国J.T.Baker公司。API3000型串联质谱仪(配有TurboIonspray离子化源以及Analyst1.4数据处理系统,美国ABSciex公司);Agilent1100四元梯度泵和自动进样器(美国Agilent公司);固相萃取仪(美国Supelco公司);BakerbondC18固相萃取柱(100mg,1ml,美国J.T.Baker公司)。1.2甲醇-异丙醇-水-甲醇c分析柱为DiscoveryC18柱(250mm×4.6mm,5μm),C18保护柱(4.0mm×3.0mm,I.D.),流动相为甲醇-异丙醇-水-甲酸(体积比为36∶8∶56∶0.1),流速0.5ml/min,进样量20μl,柱温25℃。1.3ctn986扫描方法离子源为ESI源;正离子模式检测;喷射电压为4500V;源温度为300℃;雾化气为6;卷帘气为10;碰撞气为6;扫描方式为多反应监测,用于定量分析的离子反应分别为m/z743→m/z303(CTN986)、m/z611→m/z303(芦丁)、m/z743→m/z435(曲克芦丁)、m/z727→m/z287(内标CTN987),扫描时间为150ms。相应的二级全扫描质谱图如图2所示。1.4tn987-u3000试剂取血浆100μl,置1.5ml塑料离心管中,加水60μl(补足和标准曲线相同的体积),再分别加入内标溶液(500ng/mlCTN987水溶液)20μl、水200μl、酸化试剂(0.25mol/LH3PO4)100μ1,涡流3min,离心10min(16000×g)。取全部上清液置已经活化好的SPEC18柱上,先用2×1ml去离子水冲洗,再用2×1ml甲醇洗脱。收集甲醇洗脱液,于50℃下以空气流挥干,残余物用150μl甲醇-水-甲酸(体积比为30∶70∶0.1)复溶,取20μl进行LC-MS/MS分析。1.5ctn986/芦丁/曲克芦丁单次给药的安全性ICR雄性小鼠243只,体质量约20～25g,随机分成维拉帕米预处理、非处理组和静脉注射3大组,每组81只;每大组再随机分为CTN986、芦丁和曲克芦丁组,每组27只。预处理组先灌胃给予5mg/kg的维拉帕米,连续3d,2次/d,期间不断食。预处理组和非处理组于第3天末禁食12h后,分别灌胃给予CTN986(200mg/kg)、芦丁和曲克芦丁(100mg/kg)。静脉注射组分别尾静脉注射CTN986、芦丁和曲克芦丁(给药剂量均为10mg/kg)。灌胃给药组于给药前和给药后0.08,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0和12.0h眼眶采血0.5ml,静脉注射组于给药前和给药后0.03,0.08,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,和8.0h眼眶采血0.5ml,离心10min(6000×g),分离出血浆,于-20℃冷冻保存待测。1.5数据处理和分析应用Winnolin药代动力学软件对所测数据进行分析,获得相关的药动学参数。2结果2.1克氏原螯虾叶片分子m/z303和曲克芦丁的主要碎片采用ESI源,在正离子检测方式下,获得了CTN986、芦丁和曲克芦丁的一级全扫描质谱,主要生成[M+H]+峰。继续对基峰离子进行二级质谱分析,CTN986和芦丁的主要碎片均为脱糖后的苷元离子m/z303,曲克芦丁的主要碎片为脱糖后的离子m/z435。选取在多反应监测(MRM)扫描方式下,对待测物的各质谱参数进行优化。另外,由于CTN986的[M+H]+离子(m/z743)在离子源内能够发生源内裂解,产生失去一个糖的碎片离子m/z611,而这个碎片离子又与芦丁的[M+H]+离子相一致,并且都能在二级质谱中产生苷元离子m/z303,从而干扰芦丁的测定,为了避免这种因源内裂解而产生的干扰,必须使CTN986和芦丁实现完全的色谱分离。2.2色谱柱的选择应用LC-MS/MS技术进行定量分析时,选用短的色谱柱可以缩短保留时间,提高分析速度。但在此实验中,使用短柱很难实现CTN986和芦丁的基线分离,并且存在明显的基质抑制现象,最后我们选择了250mm×4.6mm的DiscoveryC18色谱柱。另外,为了改善色谱分离、提高质谱响应,我们对流动相进行了优化,发现甲醇比乙腈更有利于待测物的离子化,低浓度甲酸可改善色谱峰拖尾,异丙醇则能显著提高待测物的质谱响应,最终我们选用甲醇-异丙醇-水-甲酸(体积比为36∶8∶56∶0.1)作为流动相,获得较好的峰形和质谱响应。2.3ctn986-芦丁、曲克芦丁标准溶液的配制取空白小鼠血浆100μl,除不加标准溶液和内标外,按1.4项下方法操作,进样20μl,得色谱图,如图3A;将CTN986、芦丁和曲克芦丁标准溶液(相当血浆浓度为4.0ng/ml)和内标溶液(500ng/mlCTN987)加入空白血浆,依同法操作,得色谱图,如图3B;取给药30min后收集的血浆样品,依同法操作,得色谱图,如图3C。结果表明,空白血浆中内源性物质不干扰待测物和内标的测定。2.4标准曲线的绘制取空白小鼠血浆100μl,加入CTN986、芦丁和曲克芦丁标准系列溶液各20μl,其余按1.4项下操作,使CTN986、芦丁和曲克芦丁在血浆中的浓度为4,8,16,40,80,160,400,800ng/ml,取20μl进行LC-MS/MS分析,记录色谱图。以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程即为标准曲线。根据标准曲线,各待测物的线性范围均为4～800ng/ml,最低定量限均为4ng/ml。2.5精密度、准确度取空白小鼠血浆100μl,加CTN986、芦丁和曲克芦丁质控溶液20μl,配制成低、中、高(6.0、60.0和600ng/ml)浓度的血浆样品各6份做为质控样品,连续测定3d,其余按1.4项下方法操作,并与标准曲线同时进行,计算QC样品浓度,与配制浓度对照,求得本法的精密度和准确度,结果见表1。结果表明,方法的精密度和准确度均符合生物样品定量分析要求。2.6基质效应的测定取6只小鼠的空白血浆100μl,按1.4项下方法操作,向挥干后的残余物中分别加入6、60和600ng/ml的混标溶液150μl,涡流混匀后吸取20μl进行LC-MS/MS分析,获得相应色谱峰面积M1;另取相应浓度的混标溶液20μl,进行LC-MS/MS分析,获得相应峰面积M2,用M1与M2之比值计算基质效应。结果比值均在85%～115%之间,表明CTN986、芦丁和曲克芦丁在所采用的测定条件下没有明显的基质效应。按1.4项下血浆中CTN986、芦丁和曲克芦丁的测定方法,对低、中、高3个浓度的样品进行提取回收率考察,3种浓度下CTN986的提取回收率分别为103.8%、98.2%和92.4%;芦丁的提取回收率分别为84.8%、79.1%和88.9%;曲克芦丁的提取回收率分别为85.9%、89.9%和99.8%;内标的提取回收率为102.2%。2.7固相萃取稳定性测定按1.4项下血浆中CTN986、芦丁和曲克芦丁的测定方法,对低、中、高3个浓度的血浆样品室温放置6h,-20℃冷冻放置25d,经历3次冷冻-解冻循环,经固相萃取处理后室温放置24h的稳定性进行考察。结果表明,CTN986、芦丁和曲克芦丁在这4种情况下均较稳定,其测定值与标示浓度的偏差均为-12.1%～14.7%。2.8不同剂量对小鼠的药动学行为影响应用所建立的LC-MS/MS法,测定了小鼠口服或静注CTN986、芦丁和曲克芦丁后血浆中待测物的浓度,并比较了连续3d灌胃给予P-gp抑制剂维拉帕米后(预处理组)对单次口服CTN986、芦丁和曲克芦丁(非处理组)在小鼠体内药动学行为的影响。CTN986、芦丁和曲克芦丁的平均药-时曲线见图4,药代动力学参数见表2。由表2数据可知,三者的生物利用度均较低,且由低至高的顺序依次为芦丁、曲克芦丁和CTN986。灌胃给予维拉帕米后CTN986的Cmax提高约10倍,AUC0-∞和T1/2提高约2倍;芦丁的Cmax提高约3倍,而其他药动学参数没有明显变化;曲克芦丁的Cmax提高约6倍,AUC0-∞提高约2倍,T1/2无明显变化。以上数据表明,维拉帕米预处理使CTN986的吸收增加且减缓了其在小鼠体内的消除,维拉帕米的预处理也使曲克芦丁的吸收增加,由此可初步推测CTN986和曲克芦丁可能为P-gp的底物。3固相萃取法与沉淀蛋白法的比较本项实验首次建立了同时测定小鼠血浆中CTN986、芦丁和曲克芦丁血药浓度的LC-MS/MS法,方法准确稳定,提