液相色谱-串联质谱联用法测定曲克芦丁血药浓度的不确定度评定

液相色谱-串联质谱联用法测定曲克芦丁血药浓度的不确定度评定

根据中国实验室国家认可委员会制定的《分析不确定度的评估指南》，化学检验部门应在实施清晰度标准时，向检测结果提供不确定度。一个完整的定量分析结果,不但包括测量值,还包括测量不确定度,其大小决定了测量结果的实用价值。ISO17025要求,合格的分析实验室的每个证书或报告,都应该包含有关校准或测试结果不确定度评定的说明。不确定度对于控制实验质量和优化实验方法具有非常重要的意义。为此本文对LC-MS/MS检测曲克芦丁血药浓度的方法进行不确定度评定,控制分析方法的关键步骤,减小不确定度,为方法学研究提供有益的指导。材料和方法1试剂:merk公司曲克芦丁滴丸,规格:每粒10mg,批号:071007;曲克芦丁片,规格:每片60mg,均由南京天泽医药科技开发有限公司提供;内标:芍药苷,批号:110736,中国药品生物制品检定所提供。甲醇,色谱纯,Merk公司生产;试验用水均为去离子水;其余试剂均为分析纯。MicromassQuattromicroLC-MS/MS联用仪,包括自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、2695液相色谱仪和Masslynx4.0质谱工作站,美国Waters公司产品;BS124S电子天平,德国Sartorrius公司产品;Micromax3591台式高速离心机,赛默飞世尔科技公司产品。2血浆样本的测定2.1检测离子msr色谱条件:色谱柱为HanbonKromasilC18(2.1mm×150mm,5μm);流动相为0.02%甲酸的水溶液-甲醇(55∶45);流量0.2mL·min-1;柱温40℃。离子检测方式为MRM多反应离子监测;离子化方式:气动辅助电喷雾离子化(ESI+)。曲克芦丁:[M+Na]+峰m/z765.5,子离子m/z457.1;芍药苷:[M+Na]+峰m/z503.4,子离子m/z219.1。2.2固相萃取小柱的制备于2mL离心管中精密加入血浆样品1mL,内标溶液10μL,涡旋30s,加入10%高氯酸600μL,涡旋1min,于15000r·min-1室温离心5min。吸取上清液至10mL离心管中,加入pH7.00的磷酸盐缓冲液1.4mL,涡旋30s。用甲醇1mL活化固相萃取小柱,再用pH7磷酸盐缓冲溶液1mL平衡小柱。将混合后的溶液上样后,用5%甲醇水溶液1mL淋洗,洗脱液弃去,最后用含1%甲酸的甲醇溶液0.5mL洗脱,洗脱液收集至10mL离心管中,经40℃空气流吹干后,用甲醇-水(50∶50)溶液80μL复溶,15000r·min-1离心5min,取上清溶液,进样10μL。2.3标准含药血浆的制备称取曲克芦丁10mg,置于10mL容量瓶中,加入纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得1mg·mL-1曲克芦丁的储备液。取储备液25μL加入纯水定容至10mL得2.5μg·mL-1标准溶液。取2.5μg·mL-1标准溶液400μL,加入纯水稀释至10mL容量瓶,配成浓度为100ng·mL-1的曲克芦丁标准溶液。取2mL离心管,精密加入曲克芦丁100ng·mL-1标准贮备液10μL及空白血浆1mL,涡旋混匀,得1ng·mL-1的标准含药血浆。加入内标10μL。3血样量化疗效标准根据文献方法按照以下4个步骤进行:①规定被测量;②识别不确定度来源;③不确定度分量的量化,包括:标准溶液配制引入的不确定度、标准曲线拟合的不确定度、提取回收率、重复性;④计算合成不确定度,对浓度为1ng·mL-1的血样,进行不确定度评估。其中,标准物质纯度引入的不确定度符合三角分布。标准曲线的不确定度采用加权方法来计算。结果1不确定因素的原因根据检测过程分析,评定其中主要来源,见图1。2不确定组件对各不确定度分量作图,见图2。由图2可见,提取回收率和标准曲线是本实验结果不确定度的主要分量。3扩展不确定度评定将各分量按照不确定度传播律合成:Urel=0.26。取包含因子k=2,则相对扩展不确定度:UrelEErel=U×k=0.52,扩展不确定度:UE=UrelEErel×C=0.53ng·mL-1。不确定度的来源评定不确定度的方法有自底向上(bottom-up)法、自上向下(top-down)法、基于方法学验证(validation-based)方法、拟合方程(Fitness-function)法等。本文用方法学验证数据和自底向上相结合的方法,对体内药物的不确定度评估。结果表明,提取回收率和标准曲线是最主要不确定度分量。其中,因标准曲线分量依赖于浓度范围和重复次数,在实际操作中,主要考虑前处理过程的不确定度,前处理不确定度还可以再继续细化,以找出影响这一步骤的较大因素,优化前处理方法,使测定结果更准确可靠。本实验中这一分量主要来源于固相萃取(SPE),而影响SPE的重复性的因素很多,包括固相小柱的类型、批次、柱的制备,以及冲洗、洗脱、吹干、复溶等一系列环节。这些不确定度可用灵敏系数来定量。文献报道,用PB设计,即每个因素选高低2水平,k个因素有2k次试验,将各因素高低水平结果的平均均值相减,可筛选出主要影响因素。若对前处理过程的影响因素,采用PB设计,继续进行实验,有可能找出前处理过程中的最主要不确定度来源。方法验证中的精密度和不确定度都可表示为95%的置信区间,但2者内涵不同。对同一实验,精密度指的是随机误差的大小,每次精密度实验都相当于1次抽样,抽样结果是不恒定的;而不确定度是指真值所涵盖的某一概率(一般是66.7%或95%)区间,与分析仪器、方法及条件有关,在重复性条件下,同一方法不同