曲克芦丁在大鼠肠道中的代谢与转化规律

曲克芦丁在大鼠肠道中的代谢与转化规律

特洛伊木马是一种由羟乙基化合成的半合成黄酮类化合物，能抑制红细胞血小板的聚集，防止血栓形成。同时，血氧饱和度增加，微循环改善，侧支循环增加。临床上常用于静脉、慢性静脉功能障碍、痔疮、脑梗死、长距离飞行等微血管病的治疗。口服黄酮苷类化合物的生物利用度低,血药浓度低,其肠道的首过代谢作用不容忽视。大量的肠道微生物能产生丰富的酶类,使尚未吸收的黄酮苷类化合物发生糖苷键断裂、去羟基化、甲基化等反应,甚至使黄酮类化合物的骨架C6-C3-C6断裂为各种酚酸类代谢产物。现采用培养离体大鼠肠道细菌的方法研究曲克芦丁的体外代谢,用HPLC法测定曲克芦丁的含量变化,考察细菌对曲克芦丁的分解代谢作用,探讨曲克芦丁在消化道中生物转化的一般规律。1实验部分1.1药品、试剂和仪器LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)。曲克芦丁原料药(阿拉丁,纯度97%);曲克芦丁(批号100416-201004,纯度95.2%)、芦丁(批号:100080-200707,纯度90.5%)对照品(中国食品药品检定研究院);L-半胱氨酸、L-抗坏血酸、牛肉膏、蛋白胨、营养琼脂(杭州微生物试剂有限公司);甲醇为色谱纯;水为纯化水;其余试剂为分析纯。♂SD大鼠(安徽医科大学实验动物中心,合格证号:皖医实动准字第01号)10只,200±20g。1.2方法和结果1.2.1检测条件a色谱柱为Shim-packODSC18柱(250mm×4mm,5μm),流动相为甲醇(A)-水(含1.7%冰乙酸,B),梯度洗脱(0~15min、41%A,15~30min、41%~65%A,30~40min、65%~41%A),流速为1.0mL·min-1,检测波长为350nm,柱温40℃,进样量20μL,以芦丁为内标。1.2.2肠道菌液的制备取溶液A(0.78%K2HPO4)37.5mL、溶液B[0.47%KH2PO4+1.18%NaCl+1.2%(NH4)2SO4+0.12%CaCl2+0.25%MgSO4·H2O]37.5mL、溶液C(8%Na2CO3)50mL、25%L-抗坏血酸2mL、L-半胱氨酸0.5g、牛肉膏1g、蛋白胨1g、营养琼脂1g,加蒸馏水至1L,用盐酸调pH7.5~8.0,过滤后分装,于121℃高压灭菌15min,得厌氧培养液,于4℃保存。取大鼠新鲜粪便与生理盐水,按1g∶4mL配制成肠道菌液。取1mL肠道菌液,加入9mL厌氧培养液,混匀,得10mL肠菌培养液。1.2.3贮备液的配制精密称取曲克芦丁和芦丁对照品各10.0mg,分别置10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,制成1mg·mL-1的贮备液。曲克芦丁贮备液用甲醇依次稀释,制成1、5、10、50、100、200、400、800μg·mL-1工作液,于4℃保存。精密吸取肠菌培养液100μL,加入芦丁溶液(20μg·mL-1)100μL和甲醇1mL,涡旋混匀1min后,于1×104r·min-1离心10min,取上清液于40℃吹干,残渣用100μL流动相复溶,得供试品溶液。1.2.5试验样的制备取空白肠菌培养液,加入曲克芦丁工作溶液,制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg·mL-1肠菌培养液样品,按“1.2.3”项下方法处理后进样。以曲克芦丁与内标峰面积的比值为纵坐标、曲克芦丁的浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程:Y=0.1213X-0.0239(r=0.9999),曲克芦丁0.1~80μg·mL-1与峰面积比值的线性关系良好。1.2.6提取回收率试验取空白肠菌培养液,加入适量曲克芦丁对照品溶液,制成0.5、5.0、10.0μg·mL-1低、中、高浓度样品,每个浓度平行制备5份,按“1.2.3”项下方法处理后进样,计算方法回收率;同时制备0.5、5.0、10.0μg·mL-1曲克芦丁对照品溶液,直接进样;同等浓度肠菌培养液中曲克芦丁峰面积与曲克芦丁对照品峰面积的比值即为提取回收率(表1)。同法配制低、中、高浓度的肠菌培养液样品,按“1.2.3”项下方法处理后进样,同日和连续5d各测定5份样品。计算得日内和日间精密度(表1)。1.2.7样品处理和定量测定取“1.2.2”项下新鲜配制的肠菌培养液21份,分为7组。分别加入0.50mg曲克芦丁,混匀,吹氮气除空气后,密封,造成肠道缺氧环境,置37℃分别培养0、1、2、4、6、12、24h后取出样品。按“1.2.3”项下方法处理后进样测定。将各时间点曲克芦丁的浓度对时间作图。由图2可知:曲克芦丁在大鼠肠道细菌中的代谢速率较快,24h后即可代谢完全。1.2.8干浸膏的制备按“1.2.2”项下方法配制肠道菌群培养液2L,加入曲克芦丁厌氧液培养24h,培养液用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,减压浓缩,蒸干得干浸膏。采用硅胶柱层析(氯仿-甲醇梯度洗脱),氯仿-甲醇(10∶1)洗脱部分在薄层板上与曲克芦丁苷元的斑点一致,合并洗脱液并回收溶剂,将氯仿重结晶,得到代谢产物。1.2.9曲克芦丁苷元3a5e的代谢产物,即为3.代谢产物为黄色粉末,分子式为C12H22O10。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.84(1H,m,2'-ArH),7.81(1H,s,6'-ArH),7.17(1H,d,J=8.5Hz,5'-ArH),6.79(1H,s,8-ArH),6.35(1H,d,J=1.9Hz,6-ArH),4.09(6H,m,J=11.6、5.3Hz,-OCH2-),3.78(6H,m,J=19.4、14.5Hz,-CH2OH)。13CNMR(75MHz,DMSO-d6):δ176.08(C=O),164.48(C-7),160.34(C-5),156.14(C-9),150.38(C-4'),147.97(C-2),146.52(C-3'),136.55(C-3),123.35(C-1'),121.87(C-6'),113.36(C-5'),113.18(C-2'),104.04(C-10),97.91(C-6),92.58(C-8),70.84(7-OCH2-),70.49(3'-OCH2-),70.36(4'-OCH2-),59.63(7-CH2OH),59.51(3'-CH2OH),59.32(4'-CH2OH)。以上数据与文献的一致,故确定该代谢产物为曲克芦丁脱去芸香糖得到的曲克芦丁苷元,即3',4',7-三(-O-羟乙基)槲皮素。2曲克芦丁的检测曲克芦丁的最大吸收波长是254、350nm,且在254nm处的吸收比350nm略大,但254nm处的干扰峰太多,无法将曲克芦丁与杂质分开,所以,选择350nm作为检测波长。曾尝试用乙腈、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿萃取处理肠道细菌培养液,结果显示:乙腈和异丙醇萃取后的样品仍含较多杂质,而氯仿和乙酸乙酯萃取后的样品,杂质虽然减少很多,但萃取率同时降低,最终选择用甲醇萃取。取甲醇层吹干后,用流动相复溶测定,药物能够很好地分离出来,肠菌培养液中的少量杂质不干扰曲克芦丁的测定。文中结果表明:大鼠肠道细菌能快速地破坏曲克芦丁的糖苷键,将其代谢为苷元。口服曲克芦丁主要经胃肠道吸收,这可能是造成口服曲克芦丁后血药浓度较低的原因之一。在大鼠尿液中未检测到曲克芦丁的苷元,因此,有必要通过研究口服曲克芦丁的吸收机理及体内转化过程,来阐明曲克芦丁在体内发挥药效的物质基础。CLCnumber:R917Documentcode:AAr