光谱核型分析技术在染色体检测中的应用

光谱核型分析技术在染色体检测中的应用

染色突变是辐射损伤的评估指标。通过对人类血巴氏合金谱损伤的分析计算，我们可以对患者在核事故发生时的辐射剂量进行估计。细胞遗传学检查方法之一的染色体核型分析技术因其实用性,已经成为染色体异常的常规筛选技术。但是利用传统的G、R、Q带通常无法检测到染色体结构上的细微变异,更难以获得精确的结果。荧光原位杂交(FluorescenceInSituHybridization,FISH)技术具有高度的敏感性和特异性,已成为另一有力的细胞遗传学研究工具,并与核型分析互相补充联合应用。Burak等用FISH技术检验核工厂工人血淋巴细胞慢性辐射照射的易位发生率。Kodama等用FISH技术对染色体畸变分析估计辐射剂量,绘制生物效应曲线,认为这种技术对早期受照者剂量估算或重建比常规法更为敏感。随着探针制备的完善与发展,进一步衍生出染色体涂抹(chromosomepainting,CP)、比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)及反向染色体涂抹(reverseCP,RCP)等技术。这些技术的联合应用,丰富了细胞遗传学研究内容,使细胞遗传学向分子领域发展,并在临床和科研工作中得到广泛应用。在FISH技术基础上又发展出多色荧光原位杂交技术:光谱核型分析(spectralkaryotyping,SKY)、多重FISH(M-FISH)和彩色显带FISH(Rx-FISH),它们一次成像可同时区分24条染色体,使复杂染色体异常的筛查成为可能,并且都能显示相当多的数目和复杂结构的改变。尤其是当基因变异发生在与G带(G-banding)极为相似的染色体片段时,应用SKY技术就能作出快速而准确的诊断,更可以揭示常规分析方法难以识别的稳定性畸变如易位、重排和一些未知来源的标记染色体。SKY技术对辐射损伤、人群放射性监护中辐射剂量的快速测定和快速估算有着广泛的应用前景,SKY技术检测染色体异常可作为治疗监测和随访过程中检测微小残留病变的有效指标。因此,现在SKY技术已经被公认为准确、高效的细胞遗传学研究方法。本文主要介绍SKY的方法及原理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1探针池的制备SKY探针是由24种人类染色体涂染探针的混合物。其中每种探针分别用5种荧光素的不同组合进行标记,制备成探针池。humanSpectralkaryotypingReagent和SkyPaintTM试剂盒购于美国AppliedSpectralImaging公司。1.1.2ssc的稀释RNA酶、胃蛋白酶、甲酰胺(去离子)、Tween-20(Sigma公司),RPMI1640(GIBCO公司),DAPI、rubbercement(美国VYSIS公司),20×SSC贮存液(NaCl174g,柠檬酸钠88.2g,三次蒸馏水配成1000mL)稀释成1×SSC、2×SSC、4×SSC应用液备用。1.1.3仪器SKY(SpectralKaryotyping)染色体图像自动分析仪(德国Leice公司)。1.2方法1.2.1体外膜消化剂的制备(1)染色体标本的制备:参照国家标准《染色体畸变分析法估算生物剂量的方法》(GB/T12715-1991)进行细胞培养,收获进行低渗、固定、制片。于清洁干燥处,老化1周;(2)将标本在RNA酶溶液(100μg/mL)37℃孵育1小时,然后在2×SSC溶液中洗3次,每次5min,分别用70%、85%、100%乙醇溶液进行梯度脱水,自然干燥;(3)消化及固定:在含有0.01mmol/LHCL的胃蛋白酶(10mg/L)溶液中消化染色体标本5min,2×SSC洗涤,分别用70%、85%、100%乙醇溶液进行梯度脱水,自然干燥;(4)标本变性:在70%甲酰胺/2×SSC溶液中于66～72℃变性1.5min,立即放入70%、85%、100%冷乙醇溶液中进行梯度脱水,自然干燥。1.2.2介入变量取8μLSKY探针90℃水浴5min,再立即冰浴5min,37℃下预杂交30min。1.2.3密封与密封变性后的探针加入标记好的杂交区,放置盖玻片(15mm×15mm),用橡胶粘合剂(rubbercement)密封,并于湿润的容器内37℃孵育36小时。1.2.4荧光素染料法小心去除杂交时放置的盖玻片和橡胶粘合剂,在37℃预热的50%甲酰胺/2×SSC(以2×SSC为溶液配置50%的甲酰胺,pH=7.0)中洗涤5min;继之用2×SSC,1×SSC溶液各洗一次,每次5min;加200μL的3%脱脂奶粉/4×SSC/0.1%Tween20(100mL4×SSC中加入0.1mLTween20及3g脱脂奶粉),洗3次,每次2min;载玻片杂交区域滴加20μLCy5荧光素染料、加盖玻片(15mm×15mm),湿盒37℃孵育60min,4×SSC/0.1%Tween-20,室温洗3次,每次2min。再加20μLCy5.5染料,孵育洗涤同上。操作时注意避光。1.2.5特芬那加二氨基苯基吲哚(DAPI),每片15μL;直接封片15分钟观察结果。2结果与分析2.1全染色体的荧光显微观察SKY是一种波谱影像分析方法,它运用了光谱干涉仪(interferometer)及傅立叶变换(Fouriertransform),将图像中每一象素做光谱分析后再重新显示,增强了对多种荧光分析的辨别。24种全染色体涂染探针先用5种不同的荧光素组合进行不同的标记,然后将探针混合物与中期染色体进行原位杂交,通过荧光显微镜获得荧光图像并进行光谱成像。其结果分显色图像和分色图像两部分,前者可于图像获取后即刻评估所有探针的杂交质量;后者用特定的SKY软件,参照每一条染色体特有的光谱信息特征进行分析。SKY技术可同时观察和分析人类24条染色体或小鼠21条染色体,同一张图像呈现不同颜色。SKY能够发现经典遗传学技术和单独用FISH技术所不能发现的细微的染色体异常,清楚地鉴别染色体的重排,特别是易位、插入及可以产生标记染色体的许多复杂的染色体结构改变,对于各种标记染色体的来源也一目了然,补充了传统显带和FISH技术,使细胞遗传学的诊断更加稳定和精确。2.2基于daps的核型分析SKY是应用一种在多个光谱上有重叠的全染色体涂染探针,使发射光谱的所有信息用于分析。首先荧光显微镜获得染色体标本的荧光图像并进行光谱成像。然后,光线通过光谱干涉仪聚焦在数字摄像头上,获得每一个像素的干涉图像,接着形成一个三维的数据库并得到每个像素的光程差与强度的对应曲线,然后通过傅立叶转换,及SKYView软件分类,通过一种光谱分类计算法将一特定的分类色(伪色)分配到所有的人类染色体上,根据DAPI染色分辨出一个中期分裂相中所有染色体,这样在计算机屏幕上可以看到每对染色体分别由光谱产生的颜色、灰值编码和计算机模拟色。不同的染色体显示出不同的伪色,便可通过染色体颜色的不同进行核型分析。图1是采用光谱核型分析方法获取的一例肝癌患者的肿瘤组织较典型的染色体图形。图中81条染色体为近四倍体,从X、Y到常染色体每条染色体均有不同程度的丢失,大多数的染色体形成复杂易位,5号染色体二条短臂顶端出现了22号染色体标记小体。在一个中期分裂相上就能发现染色体的易位、丢失、缺失、重排、扩增、双着丝粒、等臂以及标记小体等现象。由此图可说明即使细微的染色体异常在SkyVisionTM下都将无所遁形。3融资约束与染色体异常的诊断价值及体会1999年4月在西班牙Sitges市召开了有关荧光原位杂交(FISH)技术生物剂量计问题的国际会议,认为FISH技术已经开启了快速、可靠检测稳定性染色体畸变,并能准确推算生物剂量。当受到长期低剂量辐射所致的染色体损伤时,主要表现在体细胞DNA靶分子上,引起DNA双链断裂和其后的错误修复,使中期染色体发生畸变,从而导致抑癌基因的缺失和原癌基因的激活性突变。突变的单个细胞失去正常繁殖控制,形成克隆化生长,这些染色体畸变随照射后时间延长减少。相反,稳定型畸变如易位等能够长期存留。同时,染色体的变化对癌基因的定位、早期诊断和鉴别诊断、治疗及预后的评价具有重要的意义。但是FISH技术也有其局限性,首先它只能用特异性的探针检测已知染色体的异常,其次能够同时检测的目标数受限于探针数,况且信号之间会互相干扰,因此FISH技术不能作为染色体异常的筛选试验。SKY是目前唯一能够揭示检测G带变异的彩色核型分析技术,它使恶性肿瘤染色体异常的诊断达到前所未有的准确。只有SKY才能真正做到只用一组荧光滤镜,只做一次杂交反应便可得到全部染色体的核型,它是目前为止精确度、灵敏度最高的染色体分析技术。SKY适用于鉴别与特殊表型相关的新型多发染色体异常,也可用于评价治疗的疗效和疾病的愈后。在疾病初发和治疗前检测有否分子遗传学异常非常重要,较多异常染色体的出现,常常提示染色体组的不稳定,往往和疾病的进展和侵袭相关。SKY技术检测染色体异常可作为治疗监测和随访过程中检测微小残留病变的有效指标,SKY技术为相关基因的克隆及癌症的发病机制的研究提供了更先进和有效的方法。要得到一张满意的SKY染色体标本并不容易,在制片、杂交、观察等方法需要有一定的技术和经验。我们的体会是:(1)滴片老化后细胞要用RNA酶及胃蛋白酶进行消化,以去掉周围的蛋白质,保证杂交的通透性。梯度洗脱时要注意pH值(pH=7.0),充分振荡,尽量将杂质洗脱,减少背景噪声和探针非特异