斑马鱼卵抑素对骨骼肌增殖的调控作用

斑马鱼卵抑素对骨骼肌增殖的调控作用

根据以往的研究，racemy是一个激生长因子超基因家族的成员。正如其他遗传因素超基因家族的成员一样，rax7信号分子的调节可以抑制肌肉卫星细胞的生长和成年阶段的肌肉组织的生长。正如其他遗传因素超基因家族的成员一样，racemat活性物质的第一合成出现在信号遗传、前体功能物质和c-c活动物质的形式中。前体分子通过两次蛋白质水处理工艺形成具有生物活性的抗凝剂分子。在水解活动开始之前，抗凝剂前体可以以非公共或私人价格组合形成二聚体，前体分子也可以通过亲水糖合物二聚体形成非活性二聚体，以抑制抗健素和受体的结合。根据研究，danioremote的抗肿胀性肌腱与其他高等动物相似，但也会抑制肌肉骨骼的生长。卵泡抑素(follistatin,Fst)是一种分泌性的糖蛋白具有和激活素受体ⅡB亚基(activinreceptorⅡBActRⅡB)强烈的亲和作用.Fst也具有与部分转化生长因子成员直接结合的能力,被认为是一些转化生长因子超基因家族成员信号分子的有效阻抑蛋白分子.一般认为,其直接与多数转化生长因子超基因家族成员信号分子结合的能力较弱于其与激活素(activin)的结合力[6~8].据报道,Fst可以通过竞争结合而阻抑生长分化因子-11(growthdifferentiationfactor-11,GDF-11)和抑肌素的活性.其基因敲除后的新生突变小鼠显示出肌肉量显著下降的表型,而在肌肉组织中高表达Fst的小鼠与野生型小鼠相比,出现因肌肉细胞增殖和细胞个体增大所导致的骨骼肌总量明显增长.最近研究发现,鲤科鱼类斑马鱼中存在着两种Fst基因,Fst1和Fst2.其中,Fst1是一种存在于所有硬骨鱼类的Fst种类,同源性分析表明它与其他高等脊椎动物的Fst更为相似.在斑马鱼的早期胚胎发育阶段,Fst1最早的表达出现在新生的体节外缘层细胞中,Fst1强烈表达于体节腹面和侧面区域,而该区域是鱼类骨骼肌和鳍条肌主要肌肉前体细胞集中区域,暗示Fst1与鲤科鱼类的肌肉生成发育过程相关.考虑到在小鼠肌肉组织中高表达Fst蛋白可以有效地阻止生长分化因子(包括抑肌素),利用斑马鱼骨骼肌特异的肌球蛋白轻链(myosin,lightpolypeptide2,skeletalmuscle,mylz2)基因的启动子构建了肌肉特异性高表达Fst1的斑马鱼转基因载体质粒,并通过显微注射及转基因筛选,获得了在肌肉组织中稳定高表达Fst1的斑马鱼稳定遗传转基因品系.该转基因品系的鱼体体重仅发生小量增加,但本研究发现,通过在肌肉组织中特异性高表达Fst1可以导致成年斑马鱼肌肉组织中重要成肌因子myoD和pax7基因的增强表达.而且通过组织切片观察发现,肌纤维数量的显著增加可导致该转基因品系肌肉组织增生.本研究提示,鲤科鱼类组织中的Fst具有与哺乳动物类似的对抑肌素的负调控作用.1材料和方法1.1斑马鱼fst1的结构表达斑马鱼mylz2:EGFP转基因载体由新加坡国立大学宫知远博士提供.Tol2增强子诱捕质粒由新加坡国立分子与细胞研究所VladimirKorzh博士提供.正向引物(5′-GGATCCACCATGTACCCATACGAT-GTTCCAGATTACGCT-3′)和反向引物(5′-GGATCC-TTTATTGCAGCTTATAATGGTT-3′),均含BamHⅠ识别位点,采用PCR扩增从pCMV-HA质粒(Clontech,PT3285,829~1049bp)获得一个含有多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)和SV40转录结束的多腺苷酸尾序列.扩增片段经BamHⅠ酶切后,克隆进mylz2:EGFP载体,从而获得肌肉特异性表达的中间载体.随后,通过XbaⅠ酶切与Klenow酶的碱基补平和自连反应,将该中间载体的XbaⅠ位点破坏.利用已在引物设计中加入了XbaⅠ酶切位点的正向引物(5′-AATTCGCCACAGAGGAATG-3′)和反向引物(5′-TTTATTGCAGCTTATAATGGTT-3′)将含有mylz2启动子、MCS和SVSV40转录结束的多腺苷酸尾序列的DNA片段由该中间载体中扩增出来.通过XbaⅠ酶切,克隆进Tol2增强子诱捕质粒后,获得拥有肌肉特异性表达的mylz启动子、供目的基因插入的多基因克隆位点,以及一个由斑马鱼皮肤角质蛋白8(keratin8)启动子基本元件调控的荧光蛋白EGFP表达的转基因载体.以基因库中存在的斑马鱼卵泡抑素1(Fst1)的基因序列(登录号:NM_131037)为依据,设计一对含有EcoRⅠ识别位点的正向引物(5′-AT-GAATTCGGATGCTAAGGATGCTAAAGCG-3′)和含有XhoⅠ识别位点的反向引物(5′-ATCTCGAGCTAC-TTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGCGCACACAG-CTTCCTCCG-3′).通过RT-PCR技术从斑马鱼胚胎期的总RNA提取物中扩增出斑马鱼卵泡抑素(Fst1)的全长0.9kb片段,并通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切方式将该扩增出的斑马鱼Fst1全长片段克隆入前述的肌肉组织特异性高表达的转基因载体中.斑马鱼Fst1表达将由斑马鱼肌肉组织特异、高效表达mylz2的启动子调控.同一载体中由斑马鱼keratine8启动子调控的在斑马鱼表皮细胞中表达荧光蛋白的单元将可作为转基因的筛选标记(图1(A)).位于这些功能性表达调控单元两侧的Tol2转座子臂将提高功能性表达调控单元整合到斑马鱼基因组的效率.1.2斑马鱼fst1的表达及纯化青鳉(Oryziaslatipes)的转座酶编码DNA克隆由V.Korzh博士提供.10ng的Fst1转基因质粒DNA和25ng的体外合成转座酶mRNA显微注射入1~2细胞期的斑马鱼鱼卵,具体过程按照Parinov等人所描述方法.使用Leica荧光体视显微镜对注射后鱼卵中荧光蛋白的表达情况进行观察.通过对斑马鱼表皮细胞中表达荧光蛋白的情况,对稳定发生转基因的品系进行初筛,为获得具有稳定遗传特征的转基因F1代鱼,对每尾在皮肤中表达有荧光的F0代与野生型亲本交配,观察其子代各100粒受精卵.对F1中皮肤表达荧光的鱼做进一步Fst1原位杂交实验,证实Fst1基因在肌肉组织中高量表达,从而获得转基因鱼的稳定遗传品系,并反溯出其转基因品系的原始F0代鱼.同时采用针对基因组DNA的PCR方法检查转基因片段的整合.以斑马鱼与基因组DNA为模板,通过正向引物(位于mylz2启动子区域)5′-TCAGTGGCTACAGCTCATTCA-3′和反向引物(位于斑马鱼Fst1编码区域)5′-TTTGTCTG-GTCCACCACGCAA-3′进行PCR扩增,预期的整合片段长度为981bp.这些稳定遗传的F0代鱼与野生型的交配后代中Fst1高表达阳性鱼(转基因遗传杂合子)作为后续研究材料.1.3na多聚酶抑制剂fst1的合成采用由地高辛标记(digoxigenin,DIG)的RNA探针开展原位杂交分析,其详细操作步骤按Li等人所述.将斑马鱼Fst1cDNA序列克隆至pBluescript载体,经过BamHⅠ酶切线性化后,由T7RNA多聚酶合成Fst1反义RNA探针.以经过4%多聚甲醛溶液固定的各发育时期至5dpf(daypostfertilization)发育阶段的幼苗作为原位杂交材料.杂交缓冲液成分:50%甲酰胺,5倍SSC缓冲液(1倍缓冲液成分为15mmol/LNaCl和15mmol/L柠檬酸钠,pH7.6),50mg/mL肝素,50mg/mLtRNA和0.1%吐温),70℃杂交,后与碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体孵育,加入硝基四氮唑(nitrobluephosphate,NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-bromo,4-chloro,3-indolilphosphate,BCIP)显色.1.4斑马鱼fst1,fst1的荧光定量pcrfst1,fst1的合成采用实时PCR对处在60dpf阶段的非转基因对照鱼和高表达Fst1转基因鱼肌肉组织中的Fst1、成肌因子myoD,pax7的表达水平进行检测.具体操作按照产品说明书进行.使用Trizol溶液(Invitrogen)从约100mg的斑马鱼肌肉组织中提取总RNA.随后,采用不含RNA酶的DNA水解酶去除提取的总RNA样品中可能混杂的DNA.单链cDNA由SuperScript®Ⅲplatinum®One-stepqRT-PCR试剂盒(Invitrogen)中的反转录酶合成.随后,将利用设计的特异性正向、反向引物对Fst1,myoD和pax7进行扩增(引物序列见表1),以斑马鱼持家基因β-肌动蛋白(actin)作为内参,对所扩增出的斑马鱼片段进行定量分析,并对所有扩增片段进行测序鉴定.使用SequenceDetector(PRISM7700;ABI,FosterCity,CA,USA)开展荧光实时PCR检测.每个反应体积为2µLcDNA和终浓度为2ng/μL的引物,样品最初加热至50℃保温2min,然后95℃保温10min,PCR反应:95℃保温15s,60℃保温1min,共40个循环.采用SDSv1.7a分析软件确定每个样品中的检测阈值和最小检测循环次数.1.5横截肌肉组织石蜡包埋、切片在30和60dpf阶段,对转基因和非转基因对照鱼称重.对于肌肉组织学分析,分别采取10尾非转基因和稳定遗传的转基因F1的60dpf阶段的鱼体横截肌肉组织,用Bouin’s溶液固定10h,再按照常规石蜡包埋、切片程序,经常规的伊红/美蓝(Haematoxilin/Eosin)染色,测算背鳍前端断面组织切片指定区域中的肌纤维数.2结果2.1宏观表达特征检测将经BglⅡ酶切线性化的转基因质粒与转座酶共注射入1~2细胞期的斑马鱼受精卵后,75%注射后受精卵在孵化期内显示出异常的发育缺陷,并导致胚胎死亡.这可能是由于在胚胎发育阶段Fst1的错误表达所致.典型的Fst1注射后F0代受精卵的表型特征如图1(C)所示,以a,b,c标记胚胎.180粒注射后的受精卵中仍有约45尾鱼存活至成年期(图1(D)和(E)).由于转基因载体的构架中含有表皮表达荧光蛋白的调控原件,因此可以通过对注射后的鱼卵以及F1代鱼苗的表皮细胞中表达荧光蛋白特性进行观察(图1(B)和(E)),从而便于对肌肉组织中高表达Fst1的稳定转基因鱼品系的筛选.共观察到28尾F0代斑马鱼具有表皮荧光表达特征,其中有3尾被证实为有表皮细胞荧光蛋白表达的F1代转基因鱼.通过对F1代基因组DNA的PCR检测,也证实有转基因片段的插入(图1(G)).这些稳定遗传的鱼作为F0代与野生型交配,产生F1代转基因鱼用以研究,F0~F1的阳性遗传率介于3%~7%(图1(F)).不同于最初构建Fst1高表达转基因F0代显微注射的情况,肌肉组织中高表达Fst1的F1代转基因鱼与非转基因同胞个体一样,均未观察到其胚胎期发育的显著异常(图1(E)和(F)).随后通过实时PCR反应,证实了在60dpf阶段3株独立遗传转基因品系的肌肉组织中都对应于其对照转基因阴性同胞个体具有较高的Fst1表达,其中转基因品系2或3具有相当于其非转基因个体6倍的表达水平(图1(H)).2.2fpsd的比较对鱼龄为30和60dpf,分别来自同一父母本的转基因鱼和非转基因对照鱼进行体重称量.在日龄30天时,转基因鱼与非转基因对照鱼在体重上并未表现出显著差异.然而,在日龄达到60天时,Fst1的F1代杂合子鱼体较其非转基因姊妹有8.14%的平均体重增加(表1).与抑肌素相关基因的研究相比,前人报道的在肌肉中高表达抑肌素前体突变蛋白的斑马鱼纯合子相对于其非转基因姊妹体重增加(10%~15%),但其杂合子转基因斑马鱼却未表现出任何体重的增加.虽然未进行针对Fst1转基因纯合子斑马鱼的观察,但本实验中Fst1的F1代杂合子已经表现出体重的增加,说明肌肉中高效表达Fst1具有比抑肌素前体突变蛋白更强的促进肌肉生长的作用.2.3fst1/pax7对fst1基因突变斑马鱼肌肉组织的影响为观察肌肉组织中高表达Fst1对重要的肌肉生长调控基因的影响,采用整体原位杂交技术对胚胎期的转基因鱼进行了myoD基因表达观察.结果未发现Fst1转基因鱼在胚胎期的myoD表达与非转基因鱼有显著不同(数据未显示).但采用实时PCR分析技术对日龄60天的转基因和非转基因鱼的肌肉组织中myoD的表达量进行观察,却发现在成年的Fst1转基因鱼肌肉组织中myoD的表达量较非转基因姊妹鱼有显著增高(图2).与myoD类似,成肌因子pax7在肌肉卫星细胞的活化、增殖和分化中起关键的促进作用.通过对Fst1转基因斑马鱼肌肉组织中表达的pax7检测,发现60dpf转基因斑马鱼中的pax7表达水平较非转基因同胞有明显的增高(图2).以上结果表明,肌肉组织中高表达Fst1可以促进肌肉生长活动.2.4fst1转鱼的肌纤维计数和含量为了观察Fst1转基因高表达是否会影响斑马鱼肌肉生长,取60日龄的转基因和非转基因姊妹群的典型样本对其对等区域的肌肉组织进行组织学观察,以测定肌纤维数量和肌纤维横截面面积(图3).测定了在相同放大倍数下转基因鱼和非转基因姊妹成鱼位于背鳍第一鳍条基部的截面相应区域的肌纤维数量(图3(C)~(G)),记录到在Fst1转基因鱼肌肉组织的相应区域平均具有更多的肌纤维数(转基因组:604.14±47.76,n=10;非转基因组:462.63±32.12,n=10).观察到,Fst1转基因鱼肌肉组织相同区域中存在着更多的肌纤维,因而其相应的肌纤维平均具有的截面也较非转基因姊妹鱼小(图3(D)~(G)),表明未发生肌纤维细胞的体积增大.以上结果表明,Fst1的高表达主要以肌纤维增殖(hyperplasia)而非肌纤维增大(hypertrophy)的方式促进肌肉的生长.3结构方程模型中基因td1的表达对肌肉组织生长和肌肉组织体重的影响本研究采用斑马鱼肌肉特异性高表达mylz2启动子对Fst1在肌肉组织中的增强表达,来观察高表达Fst1对鱼类肌肉生长可能具有的调控作用.起初的转基因载体注射使大量受精卵(75%)发生明显的发育缺陷,可能是由于Fst1对斑马鱼原肠期发育阶段的背腹轴决定过程中所起的关键作用所致.但尚有少数(25%)注射鱼受精卵得以存活并在其基因组中成功携带了mylz:Fst1的表达调控单元.这部分受精卵的存活可能得益于mylz启动子的肌肉表达特异性以及其在胚胎阶段表达较晚的特性.本结果表明,在肌肉组织中高效表达Fst1可以显著地增强重要的成肌因子myoD和pax7在肌肉中的表达(图2),促进肌纤维细胞的增殖,并以此方式促进斑马鱼的肌肉生长(图3).抑肌素是转化生长因子超基因家族中的主要肌肉生长调控因子.在哺乳动物中,缺少抑肌素基因的纯合子突变体表现为肌肉总量的显著增加.先前的研究也表明,通过RNA干扰和morpholino注射技术等对胚胎期的斑马鱼抑肌素功能的抑制可以导致斑马鱼在胚胎发育期的重要成肌基因的高表达并出现鱼体的大型化.可是,本研究与前期在斑马鱼中开展的另一项有关抑肌素前体突变蛋白肌肉高效表达转基因工作相似,均未能在斑马鱼胚胎期至2周龄前的斑马鱼早期发育过程中观察到成肌因子myoD和myf5的增高表达(数据未显示),也未观察到在斑马鱼早期发育过程中促进肌肉增长的表型(表2).但本研究中的mylz2:Fst1转基因斑马鱼,与过去高表达Fst1转基因小鼠出现的表型相似.成年阶段的转基因斑马鱼与非转基因对照鱼相比显示出肌肉生长增强的特征,表明在鱼类肌肉组织中转基因高表达Fst1具有对肌肉组织生长的促进作用.在鱼体重量性状方面,获得的mylz2:Fst1转基因鱼,也与前人通过显微注射抑肌素干扰性RNA导致斑马鱼在幼苗期的大型化现象的观察不同.本实验观察到杂合子Fst1转基因鱼在早期阶段,其体重与非转基因鱼并未显示出明显差异,而仅在成鱼阶段的转基因鱼体重有小量增加(表2).本实验采用的是在肌肉组织中高表达Fst1,其效应可能仅集中于肌肉组织中抑肌素功能的抑制,而抑肌素RNA注射方式则实际是对全身性抑肌素作用的抑制.本实验中,由于仅在肌肉组织中高表达Fst1,所以仅在转基因鱼肌肉组织中提供了对抑肌素活性的阻抑作用,而未影响抑肌素在鱼体其他组织中的潜在作用.从而使得本实验的转基因鱼未在幼年期就发生明显的体重增加,而是仅在成年期转基因斑马鱼肌肉组织发生增生,其表型较早期全身性抑肌素RNA干扰方式所产生的体重增加的表型相对温和.此外,也可能因为在本实验中,Fst1的表达由于受mylz2启动子调控,其表达起始于20hpf,而不同于显微注射方式,在胚胎发育的更早期就可能显现出抑制效果.Lee和McPherron,Zhu等人通过对小鼠肌肉组织中高表达抑肌素相关蛋白的观察,发现在肌肉组织中高表达Fst相对于高表达抑肌素前体突变蛋白,Fst基因的高表达具有更强的对肌肉组织生长的促进作用.值得注意的是,对高表达Fst1转基因斑马鱼成年阶段肌肉组织的成肌基因的表达、肌肉组织的增生以及体重的增加等特性的分析,与在斑马鱼肌肉组织中高表达抑肌素前体突变蛋白的观察结论对比,也得出相同的结论.其原因可能是在肌肉组织中高表达抑肌素前体突变蛋白将仅能抑制体内野生型抑肌素分子对肌肉生长的负调控作用,而认为Fst1除了可以抑制抑肌素的功能外,还可能对其他转化生长因子超基因家族成员(如生长分化因子-11等)潜在的对肌肉组织生长的抑制作用发生阻抑效果从而使其在肌肉组织中高表达Fst1,具有比抑肌素前体突变蛋白高表达更明显的效果.本研究发现,在成年mylz2:Fst1转基因斑马鱼肌肉组织中可以观察到成肌因子myoD的增强表达,而该现象并未在抑肌素前体突变蛋白高表达的转基因斑马鱼中被观察到同时,与在肌肉组织中高表达抑肌素前体突变蛋白的转基因斑马鱼相比,在肌肉组织中高表达Fst1对肌纤维的增殖更为明显.这些都可能反映出Fst1具有比抑肌素前体突变蛋白更强的促进肌肉生长的能力,而该能力的获得可能是由于Fst1对除抑肌素外的其他转化生长因子超基因家族成员的功能抑制.抑肌素基因的缺失可以导致