中国极地微生物的研究进展

中国极地微生物的研究进展苑孟中国极地微生物学考察研究简史

从1981年起,中国微生物学家即涉足南极,并于1987年发表了第一篇论文(Nichuzhietal.,1987),即《ThehetertrophicmicrobesindryVictorialandandRossIslandAntarctica》；1984年之前,中国学者曾参与南大洋水体的细菌和生物量考察,并发表过数篇论文；从1984年起,中国开始独立组队进行南极考察,中国海洋微生物学家参加了相关的考察活动；上世纪末,我们进行了中国首次北极考察,微生物研究涉足北极地区(50年代吴宝铃先生曾随前苏联学者赴北极作过考察),并发表过论文；中国南北极微生物考察研究的成果为掌握极地微生物的基本状况,及研究全球变化对该特定生态环境系统的影响奠定了初步基础；本世纪初,中国学者又开始关注世界第三极—青藏高原的微生物及其环境状况。（一）类别目前中国所取得的南极微生物主要类别见表2。中国极地微生物调查研究主要成果

由该表可见,研究的微生物以细菌为主,次为菌物(即真菌)。不完全统计表明所研究的细菌大约有38属(种),丝状菌物6属,酵母8属(种),此外尚有肠系细菌。不同功能类型的微生物包括固氮细菌、硝化细菌、石油烃降解菌、耐重金属菌、耐LPS菌、耐酸菌及卫生状况指示菌等等。南极微生物的优势菌群：α、β-变性细菌群，噬纤维菌-黄杆菌-拟杆菌群（CFBgroup）。（二）极地生态环境与环境微生物学的研究这方面的研究主要将微生物置于整个生态系统中分析,如南极磷虾集群过程、集群区及磷虾本身的微生物学研究，,在潮间带生态系统、食物链中的作用,菲尔德斯半岛及附近区域生态系统中微生物的多样性、生态结构特征、食物链及与生物/非生物因子间关系分析(吴宝铃等,1998)。（三）极地微生物的开发利用研究1、抗冻物质冷适应微生物最显著的特征便是具有相对低的代谢速率，在长期的生物进化过程中形成了一系列的适应低温的机制。这些机制包括营养物质的吸收和转运、DNA的复制合成、蛋白质的合成、合成代谢和分解代谢的正常进行、能量代谢的正常进行、细胞的分裂等。2、多不饱和脂肪酸(PolyUnsaturatedFattyAcids，PUFA)具有广泛而重要的生物功能，这已经被越来越多的人所认识。然而随着PUFA开发应用领域的扩大，来自于植物、哺乳动物和海洋鱼的PUFA远远不能满足市场需求，微生物特别是藻类、真菌能合成几乎所有的PUFA并能在工业规模上培育而被视为有开发价值的可替代的生物资源。在南极细菌中具有多聚不饱和脂肪酸(PUEA)生成能力的细菌所占比例高于其在温带海洋细菌中的比例。3、抗紫外辐射物质在南极上空的臭氧层最薄时厚度仅为平时的50%，并出现了臭氧空洞，从而使UV一B总辐照度的比例增加uv一B对藻类伤害的主要目标是藻细胞中分子中的蛋白质、色素、DNA等，抑制光合作用、生长发育，甚至导致细胞死亡。为了避免或减少UV辐射，生活在高辐射环境下的生物体形成了许多物理的或者化学的保护机制。Scytonemin、MAAs是两类抗辐射的物质，如果提取这种化合物、了解其吸收紫外线的机理，有望将其作为防止紫外线的保护剂应用到化妆品中。类胡萝卜素在保护细胞和生物体免受光、气体和感光色素等损伤中起重要作用。4、低温酶低温酶的低温催化能力，低热稳定性使其在工业应用上有以下的优势:通过温和的热处理使低温酶失活，快速而经济地终止反应;生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，可以降低成本;生产过程便于监控。5、抗菌、抗肿瘤活性物质据统计，人们己经从微生物中发现了8000多种具有抗菌和抗肿瘤活性的天然产物。然而，从陆生微生物中新发现的生物活性物质的种类正在减少，并且大部分是己知的化合物。另一方面，越来越多的传染性病菌对传统抗生素逐渐产生了抗药性，威胁人类健康的三大疾病之一的癌症也难以找到有效的治疗药物，从而迫使生物学家寻找新的天然生物活性物质来解决目前面临的问题。因此，极地微生物由于具有独特的生理机制而成为最有希望为人类提供产生具有生物活性的新化合物的微生物资源宝库之一传统的环境微生物生态学研究方法采用计数、微生物培养及鉴定，生理生化分析等手段进行，这些方法在很大程度上依赖于微生物的培养和纯种分离技术。纯培养很难，尤其是在南北极这样的极端环境中。现有研究认为在自然界中仅有0.001%一1%的微生物能够用现有的技术手段进行人工培养。而且经过平板培养微生物有机体还有可能会偏离原来自然种群的生理习性，甚至有可能偏离它们原来的基因型组合。随着各种分子生物学技术的应用，使我们不必培养微生物，而直接通过对环境中的遗传物质的研究来达到目的，也为从分子水平上开展较为全面的、无偏差的微生物生态学研究开辟了新的途径。极端环境微生物分子研究方法及进展（一）从自然样品中直接提取核酸：从环境样品中提取核酸的方法可分为两类，一是转移后裂解法，即先将微生物菌体与土壤颗粒分开，再提取DNA。另一类是直接裂解法，即在土壤中直接裂解微生物菌体后提取DNA。相比之下，直接裂解法可以提取出沉积物样品中近乎所有的微生物种群，且DNA产量大。在高效裂解细胞的同时对己释放出的DNA不予破坏是提高DNA产出率的决定因素。目前己报道的裂解法有碾磨法、超声波裂解法、液氮冻融法、变性剂热裂解法、酶解法等。需要提取DNA的方法（二）分子生物学分析1.DNA熔解(解链)及复性分析该方法可应用于微生物群落结构的分析。通过测定整个群落的碱基组成和DNA的复杂性可估计出总的群落遗传结构及其复杂性。分析DNA的熔解曲线可以得到碱基组成的于G+C%。在限定条件下，测定溶液中剪切的或热失活DNA的复性动力学可以测定DNA序列的复杂性。2.质粒指纹图谱分析:质粒的大小和数目随物种的不同有所差异。质粒数是相对稳定的,它可用来区分同一物种的不同菌株。3.低分子量RNA分布图这种方法为tRNA(75-90%个核苷酸)和5SrRNA(105-120个核苷酸)的双相电泳分离。4.结合PCR的一些技术：克隆文库分析法限制性片段长度多态性分析(RFLP)末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)变性梯度凝胶电泳(DGGE)或者温度梯度凝胶电泳(TGGE)单链构象多态性分析(SSCP)随机引物扩增多态性分析(RAPD)将两种以上的上述的分子生物学方法结合运用。①克隆文库分析法主要步骤包括：(1)样品中总DNA的提取；(2)建立16SrRNA基因克隆文库；(3)以限制性内切酶进行酶切筛选文库；(4)测序；(5)序列的比较分析。②变性梯度凝胶电泳(DGGE)或者温度梯度凝胶电泳(TGGE)在含有连续变性剂梯度或者连续温度梯度的凝胶中，加入双链的PCR产物，根据PCR扩增产物中不同G+C含量的DNA组分在凝胶中的移动速度的不同，直接反映DNA的多态性。低G+C含量的组分在凝胶中变性较快，在凝胶中的移动速度较慢，高G+C含量的DNA在凝胶中变性较慢，在凝胶中的移动速度快，从而使不同DNA在凝胶中的位置不同，产生不同的带。该项技术已经广泛应用于微生物生态学研究中，包括微生物群落多样性研究、环境变化对微生物群落影响的研究比较不同微环境微生物群落差异等。《南极中山站沉积物中微生物多样性分析及宏基因组文库研究》1.南极沉积物中微生物群落结构调查：DNA的提取纯化、PCR扩增、DGGE、序列测定和系统计划关系分析。2.南极中山站排污入海口沉积物中微生物宏基因组文库的构建和研究：沉积物中总DNA的提取、大片段目的DNA的筛选和回收、插入DNA片段末端补平、连接、体外包装。cosmid宏基因组文库的保存和阳性克隆的筛选、宏基因组文库评估、宏基因组文库中抗菌活性物质筛选、宏基因组文库中抗肿瘤活性物质的筛选、宏基因组文库中酶活筛选。《北极深海沉积物中细菌多样性研究》对溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA进行了比较;并对沉积物宏基因组中16SrDNA基因PCR扩增相关的引物序列、引物浓度、退火温度和模板稀释度等条件，以及PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)的聚丙烯酞胺凝胶浓度、变性剂浓度梯度进行了优化。1.溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法1mLTENP缓冲液(50mMTris，pH8.0，20mMEDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP)等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA。2.沉积物宏基因组DNA纯化（腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除的污染物，在PCR扩增时，极少量的腐殖酸，就会抑制DNA聚合酶的活性，干扰扩增结果）①电泳切胶回收②PEG8000纯化在上述粗提沉积物DNA溶液中加入20μL的4M的NaCl溶液与80μL13%PEG8000溶液(w/v)，冰浴放置30min;10000r/min离心15mim收集沉淀;用70%的酒精洗沉淀后11000r/min离心l0min;用灭菌的滤纸条