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文档简介
基因表达研究技术SAGERNA选择性剪切原位杂交基因定点突变蛋白质及RNA相互作用技术基因芯片及数据分析利用酵母鉴定靶基因功能其他分子生物学技术基因表达系列分析技术—SAGE(p193)定义:一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。能直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息原理:mRNA3‘末端部位存在可标识其特异性的标签,长度在9-14个bp,检测标签可获得该mRNA的表达信息。标签通过串联连接于克隆载体上,便于测序,同时根据同一标签重复次数,可计算其对应基因表达频率双链cDNA合成AE酶消化A,B连接子分离标签酶消化Klenow酶连接形成双标签片段PCR扩增流程锚定酶切割连接克隆至载体回收片段,测序,分析应用人类基因组研究组织细胞的特异基因表达构建染色体表达图谱模式生物的研究肿瘤分子机制RNA选择性剪接技术(p195)RNA选择性剪接:用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。类型:平衡剪接,5’选择性剪接,3‘选择性剪接,外显子遗漏性剪接,相互排斥性剪接。方法:RT-PCR原位杂交技术(p197)概念:将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,通过原位杂交确定杂交体在样本中的原来位置
种类:原位菌落(或噬菌斑)杂交(组织细胞)Northern原位杂交(mRNA水平)Southern原位杂交(染色体水平)原理与特点原理:原位杂交以标记的外源基因为探针,在适宜的条件下,探针与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体,然后根据探针标记的性质进行检测,放射性同位素标记的探针用自显影检测。酶标记探针通过显色反应检测。特点:原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究,不需从组织或细胞中提取核酸,对含量极低的靶序列灵敏度高。能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。
荧光原位杂交基因定点突变技术(p197)原理:通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列,用途:研究某个氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点方法寡核苷酸介导的DNA突变:含错配的寡核苷酸与目的序列退火;聚合酶延伸及连接酶连接;转化;分离RFDNA重叠延伸介导的定点突变:诱变引物扩增出两种靶片断→退火→末端补平→扩增大引物诱变法:正反(突变)向突变引物扩增→产生大突变引物→与野生型DNA和正向引物混合→退火→PCR基因敲除(p200)
基因敲除是通过DNA定点同源重组,改变基因组中的某一特定基因,在生物活体内研究该基因的功能植物基因敲除T-DNA插入失活进行植物基因敲除。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化,将一段带有报告基因的序列标签整合到基因组DNA上,如果它插入到目的基因内部或附近,就会影响其表达,从而使该基因“失活”。Ti质粒(tumor-in-ducingplasmid)转移DNA(transferDNA,T-DNA):无专一整合位点利用PCR可以筛选出基因敲除株系。酵母单杂交法(p206)原理:将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)上游,把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件结合,而激活Pmin启动子使报告基因表达。报告基因:是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,是一个表达产物非常容易被鉴定的基因用途:酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用酵母双杂交体系(p207)原理:不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能,酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用用途:分离与已知靶蛋白质相互作用基因载体:含DB的载体和含AD的载体报道株:经改造的含报道基因的重组质粒的宿主细胞
BDAD杂合蛋白激活转录功能RNA干扰(RNAi)技术(p212)RNA干扰:利用设计的双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA,从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。基因沉默:双链RNA经酶切后会形成很多小片段,siRNA和miRNA。siRNA一旦与mRNA中的同源序列互补结合,会导致mRNA失去功能,即不能翻译产生蛋白质,也就是使基因“沉默”了。转基因和同源的内源基因的表达都被抑–共抑制基因芯片(p214)原理:将一系列的核酸片段固定在芯片载
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