肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义rna1在消化系统肿瘤组织中的表达及其临床意义

肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义rna1在消化系统肿瘤组织中的表达及其临床意义

非编码长度链生成的结果是200nm的ra分子。这是racemat活性物质中的一个副产物，不能编码任何蛋白质。近几年越来越多的研究发现,lncRNA参与了多种生物学过程,如表观遗传学、转录调控和转录后调控等,特别是在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(actinfilament-associatedprotein1-antisenseRNA1,AFAP1-AS1)是—个长6810nt的lncRNA,在人类基因组中其基因定位于4号染色体上,是编码AFAP1的基因反义产物。最新文献表明,AFAP1-AS1在食管癌中高表达,并参与了食管癌的发生与发展。但是对AFAP1-AS1的认识目前仅限于这一项研究,其是否在其他组织肿瘤中也发挥作用,还不清楚。因此,本研究通过观察AFAP1-AS1在消化系统肿瘤组织及相应癌旁组织中的表达情况,探讨AFAP1-AS1在肿瘤中的作用及其是否可作为消化系统肿瘤的标志物,为进一步研究其与肿瘤的关系奠定基础。1材料和方法1.1患者利益资料收集中南大学湘雅医院和湘雅二医院2010年1月—2013年2月行手术切除并经病理科确诊的82例消化系统肿瘤及对应的癌旁组织,其中包括食管癌11例、胃癌11例、肝癌26例、结直肠癌34例,同时收集各标本的临床病理资料。此研究经伦理委员会批准,患者均签署了本研究的知情同意书。所有标本均经4%多聚甲醛溶液[0.01mol/LPBS配制,含0.1%焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)]固定,常规脱水、透明和石蜡包埋切片,制作成组织切片。利用中南大学肿瘤研究所自制的组织微阵列工具和相关技术(专利号:ZL200410022818.X)制作包含以上各种肿瘤组织标本的组织微阵列受体蜡块,并切片,用于组织微阵列切片原位杂交初步筛查。1.2原位杂交及荧光定量pcr检测收集中南大学湘雅医院和湘雅二医院2012年6月—2013年6月行手术切除的肝癌及癌旁组织70例,经4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水、透明和石蜡包埋,4μm连续切片,用于进一步的原位杂交检测。并且收集新鲜肝癌及其癌旁组织30例,立即放入液氮中保存,用于提取RNA进行荧光定量PCR检测。同时收集各标本的临床病理资料。所有患者术前均未做化学、免疫或放射等抗肿瘤治疗。经CT扫描或淋巴结清扫进行标本的病理学诊断,证实有无淋巴结转移。1.3像系统和荧光定量pcr检测原位杂交检测试剂盒MK3655-h购自武汉博士德生物工程有限公司,DAB显色试剂盒和苏木精购自北京中杉金桥生物技术有限公司,DEPC购自美国Sigma公司,总RNA提取试剂购自美国Omega公司,反转录试剂盒和荧光定量PCR检测试剂盒购自日本ToYoBo公司。紫外分光光度仪为美国Backman公司产品(型号:DU-800),凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品(型号:UniversalHoodⅡ),荧光定量PCR仪为美国AppliedBiosystems公司产品(型号:7300)。寡核苷酸探针由武汉博士德生物工程有限公司设计合成,并对3’端进行地高辛标记。AFAP1-AS1基因的3条探针序列分别为5’-TGTTTGATTCTAAGAGGACACA-GACTGCTTCATTC-3’、5’-GAGAGGT-GAGAAAGCATGTCAGGAACACAGG-3’和5’-GCCCGAGGCAATGAACAGTAGCT-CAGCTTGCATCT-3’。以GAPDH作为内参基因,3条探针序列分别为5’-CCACTTTAC-CAGAGTTAAAAGCCCTGG-3’、5’-CAGTA-GAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’和5’-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCT-CAGTGTA-3’。实时荧光定量PCR的上下游引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成,序列分别为5’-ACTGAAGAGGAACCAG-GGACAG-3’和5’-GGGGAAACTGAAAT-GAATGAAG-3’。1.4amesi安定法检测细胞因子检测,把不同浓度的针织物转化为产物,并将afap1-as1组织中的异质性探针结合起来,分子原位杂交实验方法参照试剂盒说明书进行,并稍作修改:组织切片经脱蜡、水化和2%DEPC水浸泡10min后,DEPC-PBS洗涤3次。滴加3%H2O2并室温放置10min,以灭活内源性酶。用胃蛋白酶(1mL3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀)37℃消化25min,加入1%多聚甲醛溶液(用0.1mol/LPBS溶解)于室温条件下固定10min。每张切片加入预杂交液20μL(组织微阵列切片加200μL),37℃湿盒中预杂交2～4h后,加20μL(组织微阵列切片加200μL)含有地高辛标记的寡核苷酸探针杂交液,37℃恒温杂交过夜(18～20h),并用原位杂交专用盖玻片覆盖。杂交后分别用2、1和0.25倍柠檬酸钠缓冲液(salinesodiumcitrate,SSC)梯度洗脱,去掉多余的探针。切片封闭后,滴加生物素化鼠抗人地高辛抗体(即用型),37℃温浴60min,链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育30min后DAB显色。光学显微镜下控制显色反应时间,苏木精对比染色,中性树胶封固。同时,用内参基因GAPDH的寡核苷酸探针作为每次杂交的阳性对照;以不加含探针的杂交液作为阴性对照。原位杂交结果判断:光学显微镜下对AFAP1-AS1在组织中的着色情况进行观察,采用半定量积分法判断结果。根据阳性细胞染色强度分级:无染色为0分;细胞呈浅棕色,为1分;细胞呈棕黄色而无背景染色,或细胞呈深棕色而背景呈浅棕色,为2分;细胞呈深棕色为3分。根据阳性细胞数分级:无阳性细胞为0分;阳性细胞数所占比例≤25%为1分;阳性细胞数所占比例为25%～50%为2分;阳性细胞数所占比例≥50%为3分。以上2项分数的乘积为最终得分:0分为阴性,1～2分为“+”,3～4为“++”,6～9分为“+++”。“+”～“+++”均视为阳性表达。1.5荧光定量pcrafap1-as1基因表达量检测采用TRIzol一步法抽提肝癌及癌旁组织的总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按照反转录试剂盒说明书步骤合成cDNA,保存于一20℃备用。实时荧光定量PCR的20μL反应体系:SYBRqPCRMix10μL,上下游引物各1μL(10μmol/L),cDNA产物1μL,50×ROXreferencedye0.4μL,加去RNase水补足至20μL。以GAPDH基因为内参基因,样品管和内参管均设2个复管。行两步法PCR扩增,反应条件:95℃预变性1min,然后95℃15s、60℃1min,共40个循环。荧光定量PCR结果判定:采用Ct值代表荧光定量PCR的结果。ΔCt=Ct目的基因—Ct内参基因,ΔΔCt=ΔCt肿瘤组织-Δt癌旁组织,根据公式2-ΔΔCt可以计算AFAP1-AS1在肝癌组织中的相对表达量。当该值≥2时,认为AFAP1-AS1基因过表达;若该值≤0.5,则认为该基因低表达。1.6afap1抑制剂的筛选根据AFAP1-AS1在肿瘤组织中表达与淋巴结转移情况,分别计算AFAP1-AS1作为肿瘤转移分子标志物的灵敏度、特异度、符合度、阳性预测率和阴性预测率,具体计算公式见文献。1.7afap1和afap1-as1在各肿瘤组织和肿瘤组织中的表达水平的分析采用SPSS21.0软件进行统计学分析。以上实验中每个样本组织均重复实验3次。采用χ2检验或者四格表Fisher精确检验比较AFAP1-AS1在各肿瘤组织和对应癌旁组织中的阳性率,并分析其与主要临床病理特征的关系。采用Wilcoxon符号秩检验方法分析AFAP1-AS1在30例新鲜配对肿瘤组织中的相对表达水平。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同组织中afap1-as1的表达组织微阵列切片技术初步筛查82例消化系统肿瘤组织及其癌旁组织中的AFAP1-AS1表达情况,其中包括食管癌11例、胃癌11例、肝癌26例、结直肠癌34例。结果显示,AFAP1-AS1阳性信号主要定位于肿瘤细胞或癌旁细胞的细胞质中,呈弥散性或颗粒状分布;少量细胞的细胞核和细胞质中均有阳性表达;部分组织也可见少量间质细胞的细胞质着色(图1)。AFAP1-AS1在4种肿瘤组织及对应癌旁组织中的表达结果见表1。分析发现,不同肿瘤组织中AFAP1-AS1的表达情况各不相同,并且在相应的癌旁组织中其表达情况也各不相同;AFAP1-AS1在食管癌中表达水平较高,且与癌旁正常组织中差异有统计学意义(P<0.05);在肝癌中AFAP1-AS1表达较弱,而在癌旁组织中其表达较强,两者差异有统计学意义(P<0.05);在胃癌和结直肠癌组织中,虽然AFAP1-AS1也有阳性表达,但与癌旁比较的差异均无统计学意义(P>0.05)。2.2肺癌患者afap1-as1表达分布根据组织微阵列切片初步筛查结果,对表达差异明显的肝癌组织扩大样本到70例,进一步进行原位杂交检测(图2)。结果显示,配对的70例肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织中,AFAP1-AS1表达阴性率分别为81.43%(57/70)和7.69%(5/70);2者比较分析发现,AFAP1-AS1在肝癌组织中表达水平降低(χ2=78.280,P<0.05)。2.3afap1-as1与肺癌临床病理特征的相关性分析由30对新鲜肝癌组织和癌旁对照标本成功提取RNA,总RNA的D260/D280值为1.8～2.0;琼脂糖凝胶电泳显示RNA有2条带,且28SRNA条带亮度约为18SRNA条带的2倍,说明RNA没有降解。采用实时荧光定量PCR技术完成30对配对组织中AFAP1-AS1基因的检测,得到AFAP1-AS1在肝癌及癌旁组织中的相对表达水平。分析发现,新鲜肝癌组织中AFAP1-AS1的表达水平低于癌旁组织(P<0.01,图3A),其中83.33%(25/30)的配对组织之间差异有统计学意义(图3B)。2.4AFAP1-AS1与肝癌临床病理特征的关系组织微阵列切片和原位杂交检测的全部96例肝癌组织中AFAP1-AS1表达与临床病理特征的相关性分析结果见表2。在肝癌组织中AFAP1-AS1的表达与患者临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),而且有淋巴结转移的肝癌组织中AFAP1-AS1阳性率明显低于无淋巴结转移的肝癌组织。肝癌组织中AFAP1-AS1表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度均无关(P>0.05)。2.5AFAP1-AS1作为肝癌转移分子标志物的有效性评估本研究进一步评估AFAP1-AS1作为肝癌淋巴结转移分子标志物的灵敏度、特异度、符合度、阳性预测率和阴性预测率。灵敏度反映AFAP1-AS1正确诊断肝癌淋巴结转移的能力,特异度反映AFAP1-AS1正确判断无淋巴结转移的能力,符合率阳性表示AFAP1-AS1诊断肿瘤淋巴结转移的真实性。阳性预测率表示AFAP1-AS1表达降低时,肝癌淋巴结转移诊断的可能性。阴性预测率表示由AFAP1-AS1表达时,无淋巴结转移诊断的可能性。计算得AFAP1-AS1作为肝癌淋巴结转移分子标志物的灵敏度、特异度、符合度分别为91.23%、28.21%和65.62%,具有较高的灵敏度和符合度;阳性预测率为68.75%,阴性预测率为65.00%,说明AFAP1-AS1检测结果为阴性时,该患者很可能存在淋巴结转移。3afap1-as1在其他组织及肺癌中的表达越来越多的证据表明,lncRNA与肿瘤的发生和发展具有密切的关系。lncRNA差异表达于正常组织与其对应的肿瘤组织中,而且特异性lncRNA可作为肿瘤的预测因子。目前,lncRNA在消化系统肿瘤领域的研究还处于起步阶段,发现的肿瘤特异性lncRNA还非常少。其中,肝癌高表达转录本(highlyup-regulatedinlivercancer,HULC)是报道最多的一个与消化系统肿瘤密切相关的lncRNA。Wang等研究发现,在肝癌细胞中环腺苷酸反应元件结合蛋白(c-AMPresponseelementbindingprotein,CREB)可以通过与微小RNA372相互作用来上调HULC的表达。已有研究证明,HULC在肝癌及结直肠癌肝转移的组织中特异性高表达。另外,研究还发现一些与消化系统肿瘤有关的lncRNA,如OCC-1、E2F4antisenseH19、HOTAIR、Kcnqlot1和PTENP1等,但还没有更为详细的研究报道。本研究通过组织微阵列切片初步筛查了食管癌、胃癌、肝癌和结直肠癌4种常见消化系统肿瘤组织中AFAP1-AS1的表达,其中在食管癌中AFAP1-AS1表达上调,在肝癌中AFAP1-AS1表达却明显下调,而在胃癌和结直肠癌中表达与癌旁没有明显差异。提示AFAP1-AS1在不同的组织中表达情况不同,其中可能在食管癌和肝癌的发生和发展过程中起到一定的作用。Wu等在对食管癌DNA甲基化全基因组筛查中发现,AFAP1-AS1是一种低甲基化的lncRNA;进一步发现,AFAP1-AS1在食管癌中表达上调,并且AFAP1-AS1高表达能促进肿瘤细胞增殖与侵袭转移。本实验检测AFAP1-AS1在食管癌中表达的结果与文献的结果一致,并且发现AFAP1-AS1在肝癌中显著低表达。通过扩大肝癌组织的病例数,本研究进一步检测AFAP1-AS1在肝癌中的表达情况。结果发现,在70例肝癌患者中81.43%的肿瘤组织AFAP1-AS1表达下调,与初筛的结果一致。并且实时荧光定量PCR结果也显示,AFAP1-AS1在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,提示AFAP1-AS1对肝癌发生和发展有重要作用。在对上述96例肝癌的临床病理特征分析中发现,AFAP1-AS1的表达与肝癌的临床分期和淋巴结转移有密切的关系,而这些临床病理特征