酶促反应动力学课件

酶促反应动力学一、底物浓度对酶反应速度的影响二、米氏公式的导出三、米氏方程的讨论四、米氏常数的求法五、多底物的酶促反应动力学酶促反应动力学一、底物浓度对酶反应速度的影响一、底物浓度对酶促反应速度的影响21345678002

4

68底物浓度mmole生成物浓度806040200S+E↓P(固定酶的浓度在固定时间内反应)（单底物酶促反应）一、底物浓度对酶促反应速度的影响2134567800酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。酶的底物饱合现象——中间络合物学说非酶催化剂酶催化剂中间产物假说证据酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和Michaelis与

Menten提出酶催化动力学MichaelisMentenNelson&Cox(2000)LehningerPrinciplesofBiochemistry(3e)p.2581913年Michaelis与Menten提出酶催化动力学MicKs为底物解离常数（底物常数）二、米氏方程的导出1、根据酶反应的中间复合物学说：假定E+SES迅速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度下，K3<<K2即K3反应特别慢，可以忽略不计。Ks为底物解离常数（底物常数）二、米氏方程的导出1、根据酶反

米式方程的导出：早年的米式方程基于快速平衡假说①

在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。②

因为研究的是初速度，P的量很小，由P+EES可以忽略不记。③

游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故，[ES]的动态平衡与ESP+E没有关系（既K1、K2

＞＞K3

）

米式方程的导出：①

在反应的初始阶段，[S]远远ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]反应速度：KS现在称为底物常数ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]反应速度：

米氏推导酶促反应速度公式时，认为[ES]的积累是快速平衡的结果，而没有考虑ESE+P这一步。而Briggs认为应当考虑这一步，因为并不总是K3<<K2,ESE+P这一步也可能速度很快，这时，E，S和ES将不能处于一个平衡状态。布氏提出稳态理论。1925年Briggs和Haldane提出稳态理论ES+P+ES的生成量与消失量相等，故平衡时

[ES]浓度成一稳定状态。SEE米氏推导酶促反应速度公式时，认为[ES]的积累SteadyState时

ES的浓度恒定SPEES反应时间浓度SteadyState时ES的浓度恒定SPEES反应稳态理论(SteadyStatetheory)的假设稳态理论(SteadyStatetheory)的假设稳态理论下米氏方程的推导E+SESE+P(vo)k2k1k3

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]vo=Vmax

[S]Km

+

[S][E0]

=

[E]

+

[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0]酶必须先与底物结合ES的生成量等于其消失量[ES]浓度恒定SteadyState由上式出发可推得Michaelis-Menten公式[E0]

酶的总量稳态理论下米氏方程的推导E+SES稳态理论下米氏方程的推导E+SESE+P(vo)k2k1k3S稳态理论下米氏方程的推导E+SES稳态理论下米氏方程的推导[E0]

=

[E]

+

[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0][E0]

酶的总量稳态理论下米氏方程的推导[E0]=[E]+[ES]v当[S]<<Km时当[S]>>Km时当[S]=Km时米氏方程定量的表达了反应初速度与底物浓度之间的关系与实验结果相符合。三、米氏方程的讨论

米氏方程的意义当[S]<<Km时当[S]>>Km时当[S]=Km时米氏方程①物理意义:

当反应速度达到最大反应速度（Vmax)的一半时的底物浓度.②Km的引伸意义:Km是酶学研究中的重要研究数据,表示了酶的一个基本性质.Km值是酶的特征常数之一,与酶的性质有关,而与酶的浓度无关,不同的酶,其Km值不同.对于专一性不强的酶来说对于每一个底物都有一个相应的Km值.2、米式方程中各参数的意义

1)Km的意义三、米氏方程的讨论①物理意义:当反应速度达到最大反应速度（Vmax)的一半时Km与天然底物Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S]越灵敏。V[S]1/2VmaxKm三、米氏方程的讨论Km与天然底物V[S]1/2VmaxKm三、米氏方程的讨论快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别当K1、K2>>K3时，即ESP+E是整个反应平衡中极慢的一步“稳态平衡=快速平衡+慢速平衡”：当ESP+E极慢（K3/K1极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡三、米氏方程的讨论快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别当K1、K2>>K3时，Km、Ks与底物亲和力Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。只有当K1、K2>>K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势K3／K1有关）三、米氏方程的讨论Km、Ks与底物亲和力Km是ES分解速度（K2+K3）与2)Km值的用途——根据Km推测代谢的方向及程度根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断限速步骤（Km最大的步骤不一定是限速步骤）根据Km值的大小判断分支代谢的流向酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强化则降低Km，弱化则提升Km

）三、米氏方程的讨论2)Km值的用途——根据Km推测代谢的方向及程度三、米氏方3)米式方程的用途（1）根据[S]求V（2）根据V（或相对速度a）求[S]三、米氏方程的讨论设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=213)米式方程的用途（2）根据V（或相对速度a）求[S]三、米三、米氏方程的讨论（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据。当v=1/2Vmax时，表示活性部位有一半被占据。3)米式方程的用途三、米氏方程的讨论（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度当v4)、Vmax与K3（

Kcat）的意义Vmax不是一个常数，它取决于酶的浓度，它是一个酶反应体系的速度的极限值。Vmax=K3[E0]K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），表明酶的最大催化效率三、米氏方程的讨论4)、Vmax与K3（Kcat）的意义三、米氏方程的讨论5)、Kcat/Km

表示酶的实际催化效率

三、米氏方程的讨论在生理条件下，大多数酶并不被底物所饱和，在体内[S]/Km的比值通常介于0.01到1之间[S]<<Km时：Kcat/Km的上限是K1，既生成ES复合物的速度(酶促反应的速度不会超过ES的形成速度K1，在水相中不会超过108~109）5)、Kcat/Km表示酶的实际催化效率三、米氏方只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底酶促反应动力学课件1、

Lineweaver-Burk

双倒数作图法四、米氏常数的求法1、

Lineweaver-Burk

双倒数作图法四、米氏选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。该作图的缺点是：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远。从而影响Km和Vmax的准确测定。四、米氏常数的求法选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量四、米氏常数的求2、Eadie-HofsteeV—V/[S]作图法3、Hanes-Woolf作图法

4、Eisenthal作图法

5、Hill作图法（寡聚酶）-LogKmLog[S]四、米氏常数的求法2、Eadie-HofsteeV—V/[S]作图法（寡聚（一）双底物酶促反应动力学机理序列反应或单一置换反应:有序反应Orderedreaction(orderedBiBi)随机反应Randomreactions(randomBiBi)乒乓反应或双置换反应五、多底物的酶促反应动力学（一）双底物酶促反应动力学机理序列反应或单一置换反应:五、多1、有序反应机理只有先导底物A(Leadingsubstrate)首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternarycomplex)转变为EPQ，B的产物P先释放，A的产物Q后释放。●在缺少A时，B不能与E结合五、多底物的酶促反应动力学E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQ反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数NAD与NADH相互竞争E上的NAD结合部位1、有序反应机理五、多底物的酶促反应动力学E→AE→2、随机反应机理底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB→QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。五、多底物的酶促反应动力学限速步骤是AEB→QEPA与Q相互竞争E上的底物结合部位A，B与P相互竞争E上的底物结合部位B反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数2、随机反应机理五、多底物的酶促反应动力学限速步骤是AEB3、乒乓反应机理五、多底物的酶促反应动力学整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式3、乒乓反应机理五、多底物的酶促反应动力学整个反应历程中只有谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶符合双置换、双底物机制的酶谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶符合双置换、双底物机制的酶（二）双底物反应的动力学方程1、乒乓机制的动力学方程KmA：[B]达到饱和浓度时A的米氏常数KmA’：A的表观米氏常数Vmax：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度五、多底物的酶促反应动力学（二）双底物反应的动力学方程1、乒乓机制的动力学方程KmA2、序列机制的底物动力学方程五、多底物的酶促反应动力学2、序列机制的底物动力学方程五、多底物的酶促反应动力学酶促反应动力学课件六、pH值对酶反应速度的影响七、温度对酶促反应速度的影响八、酶浓度对反应速度的影响九、激活剂对酶活性的影响十、抑制剂对酶活性的影响第四节酶促反应动力学（二）六、pH值对酶反应速度的影响第四节酶促反应动力学（二）

大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH。典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线。六、pH对酶促反应速度的影响2.最适pH(optimumpH)大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表2.pH影响酶活力的因素①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。③影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。3.pH对酶稳定性的影响酶的提纯及测活时要选择酶的稳定pH，通常在某一pH缓冲液中进行。一般最适pH总是在该酶的稳定pH范围内，故酶在最适pH附近最为稳定。六、pH对酶促反应速度的影响2.pH影响酶活力的因素六、pH对酶促反应速度的影响4.酶活力——pH曲线的类型最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。六、pH对酶促反应速度的影响4.酶活力——pH曲线的类型六、pH对酶促反应速度的影响1．最适温度及影响因素温度对酶促反应速度的影响有两个方面：①提高温度，加快反应速度。

温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为1~2。②提高温度，酶变性失活。在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimumtemperatureTm）.七、温度对酶促反应速度的影响1．最适温度及影响因素七、温度对酶促反应速度的影响最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的八、酶浓度对酶促反应速度的影响

v===在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，速度与酶的浓度呈正比。酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，故反应速度增加。八、酶浓度对酶促反应速度的影响

v===在一定温度激活剂（activator):凡是能提高酶活性的物质。1、

无机离子的激活作用（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）阴离子：Cl-、Br-、PO43-（3）氢离子不同的离子激活不同的酶。不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg2+与Ca2+之间常常拮抗，但Mg2+与Zn2+常可替代。激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM九、激活剂对酶活性的影响激活剂（activator):凡是能提高酶活性的物质。九、激2、简单有机分子的激活作用①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。3、蛋白酶对酶原的激活酶原可被一些蛋白酶选择性水解肽键而被激活，这些蛋白酶也可看成为激活剂。九、激活剂对酶促反应速度的影响2、简单有机分子的激活作用3、蛋白酶对酶原的激活九、激活剂对抑制作用(inhibition):

酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失。变性作用(denaturation):

由于酶分子的次级键(酶分子结构）受到破坏而使酶活性下降或失活的现象.抑制剂:

不引起酶蛋白变性但能与酶分子的必需基团发生化学反应,从而引起酶活力的下降甚至丧失,能引起这种酶活力下降或丧失的物质叫抑制剂.变性剂:

不专一作用于某一类化学基团,而只是破坏蛋白分子中次级键的化学物质.叫变性剂.失活:

是指酶活力的丧失.变性剂和抑制剂均可使酶失活.十、抑制剂对酶活性的影响抑制作用(inhibition):酶的必需基团化学性质的改十、抑制剂对酶活性的影响抑制作用变性作用抑制与变性的结果是酶失活抑制作用：酶的结构与功能，催化机制、代谢途径研究的基本手段，药物设计的理论依据十、抑制剂对酶活性的影响抑制作用变性作用抑制与变性的结果是酶（一）抑制程度的两种表示方法相对活力分数相对活力百分数2、抑制率抑制分数抑制百分数1、相对活力十、抑制剂对酶活性的影响（一）抑制程度的两种表示方法相对活力分数相对活力百分数2、抑（二）抑制作用的类型不可逆的抑制作用:这一类抑制剂通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的基团结合,而使酶分子失活.不能用透析,超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性.可逆抑制剂作用:这类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的,可用透析,超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性.竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(noncompetitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)

十、抑制剂对酶活性的影响（二）抑制作用的类型十、抑制剂对酶活性的影响（1）竞争性抑制抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。十、抑制剂对酶活性的影响（1）竞争性抑制十、抑制剂对酶活性的影响（2）非竞争性抑制底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+十、抑制剂对酶活性的影响（2）非竞争性抑制某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：（3）反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I→ESI≠P常见于多底物的酶促反应中十、抑制剂对酶活性的影响（3）反竞争性抑制十、抑制剂对酶活性的影响EnzymeInhibition(Mechanism)CompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferentsiteCompeteforactivesiteInhibitorSubstrateCartoonGuideEquationandDescription[I]bindstofree[E]only,andcompeteswith[S];increasing[S]overcomesInhibitionby[I].[I]bindstofree[E]or[ES]complex;Increasing[S]cannotovercome[I]inhibition.[I]bindsto[ES]complexonly,increasing[S]favorstheinhibitionby[I].E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EI

←

↑E+S

→

ES

→

E+P++

I

I↓↓EI

+

S

→EIS

←

↑

↑E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EIS

←

↑XEnzymeInhibition(Mechanism)C（三）可逆抑制作用动力学十、抑制剂对酶活性的影响1、竞争性抑制：酶浓度恒等:由米氏学说:（三）可逆抑制作用动力学十、抑制剂对酶活性的影响1、竞争性抑十、抑制剂对酶活性的影响十、抑制剂对酶活性的影响Vmax不变Km变大，而且随[I]浓度的增大而增大交于y轴Vmax不变交于y轴十、抑制剂对酶活性的影响2、

非竞争性抑制十、抑制剂对酶活性的影响2、

非竞争性抑制抑制程度决定于[I]和Ki，与底物的Km和[S]无关动力学方程：十、抑制剂对酶活性的影响交于x轴Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）抑制程度决定于[I]和Ki，与底物的Km和[S]无关动力学十、抑制剂对酶活性的影响3、反竞争性抑制十、抑制剂对酶活性的影响3、反竞争性抑制Km及Vmax都变小。一组平行直线十、抑制剂对酶活性的影响动力学方程：抑制程度决定于Km、Ki、[S]、[I]Km及Vmax都变小。一组平行直线十、抑制剂对酶活性的影响动KmEnzymeInhibition(Plots)CompetitiveNon-competitiveUncompetitive

DirectPlotsDoubleReciprocalVmaxVmaxKmKm’[S],mMvo[S],mMvoIIKm[S],mMVmaxIKm’Vmax’Vmax’VmaxunchangedKmincreasedVmaxdecreasedKmunchangedBothVmax&KmdecreasedI1/[S]1/Km1/vo1/

VmaxITwoparallellinesIIntersectatXaxis1/vo1/

Vmax1/[S]1/Km1/[S]1/Km1/

Vmax1/vo

IntersectatYaxis=

Km’KmEnzymeInhibition(Plots)Com（四）一些重要的抑制剂十、抑制剂对酶活性的影响1、不可逆抑制剂：

(1)非专一性不可逆抑制剂与酶活性中心及活性中心外某一类或几类必需基团反应①有机磷的酰化物二异丙基磷酰氟（DFP）和许多有机磷农药。抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂键。强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。（四）一些重要的抑制剂十、抑制剂对酶活性的影响1、不可逆抑制十、抑制剂对酶活性的影响十、抑制剂对酶活性的影响②有机汞、有机砷化合物

抑制机理：使酶的巯基(-SH)烷化解毒剂：二巯基丙醇（BAL）、Cys、GSH等过量的巯基化合物。③