RFLP限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性RFLP汇报人:郭建强限制性片段长度多态性RFLP

1RFLP技术的简介

2RFLP中应用的限制性内切酶

3RFLP的实验步骤

4RFLP技术的应用

分子标记的历史第一代分子标记技术RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段长度多态性）第二代分子标记技术

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片断长度多态性）事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（单核苷酸多态性)RPLF技术的简介个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异成为DNA多态性。假如DNA顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA时，便会产生与正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。

RFLP作为一种“遗传路标”，对人类基因组制图提供必要的标记，当多态性顺序与人类遗传性疾病位点连锁时，可作为遗传缺陷的产前诊断或是鉴别携带者的标记，还可以应用于亲子鉴定和群体研究等方面。RPLF技术的原理利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

RFLP的类型1.点的多态性表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。2.序列多态性①由于DNA顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。②由于高变区（highlyvariableregion）内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中的相对位置。

RFLP中应用的限制性内切酶限制性内切酶（restrictionendonuclease）是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的DNA序列，并将DNA切断。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子记则有几个甚至上千个。分子记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。

三种限制性内切酶如酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功能，但切割点不在识别位点，而在1kb（不少于400bp）或nkb(最多7kb)处随机切割.I型酶II型酶III型酶就是通常指的DNA限制性内切酶，II型限制酶分子量小、仅需Mg2＋作为催化反应辅助因子。它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。与I型酶特性类似，也有甲基化功能。不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程的意义也不大RFLP技术的步骤Southern杂交转膜凝胶电泳分开DNA片段酶切不同个体DNA的提取数据分析PCR扩增目的片断抽提DNA或PCR扩增后的DNA经内切酶酶切,然后在琼脂糖凝胶电泳分析，适合较小分子的DNA分析DNA先酶切，电泳分离，变性后转移到尼龙膜或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，最后做放射自显形，就可检测出多态性条带。不同个体DNA的提取1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。酶切一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。

凝胶电泳分开DNA片段在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离