小麦背景中的加州野大麦染色体分析

小麦背景中的加州野大麦染色体分析

最初的植物分类研究主要基于植物的形态、解剖和其他材料。然而，由于不同的研究人员对植物形态的理解不同，尤其是在研究形状相似的植物时，同一植物通常被划分为不同的类别，从而导致植物分类的混乱。一种生物的染色体核型相对稳定。随着染色体制片技术的改进,特别是20世纪70年代初建立了染色体分带技术后,核型分析更加精确。近年来细胞学、计算数学和数字图像分析技术的相互渗透,计算机技术广泛地应用到核型分析研究中,相继开发出了各种进行核型分析的硬件、软件,从而实现核型分析的自动化或半自动化。加州野大麦(H.brachyantherumsspcaliforni-cum)是大麦属的一个野生种,属于禾本科小麦族大麦属(Hordeum),为多年生二倍体自花授粉草本植物,2n=14,染色体组为HH,主要分布于北美。加州野大麦具有抗大麦黄矮病(BarleyYellowDwarfVirus,BYDV)和冻害的优良特性,适应性强,尤其在低氮条件下有很强的生存能力,在小麦育种中有着重要潜在利用价值。Gupta&Fedak成功地获得普通小麦中国春(Chinesespring,CS)与加州野大麦杂种F1,在F1自交后代中鉴定出自发产生的双二倍体(2n=56)。王秀娥等对该双二倍体进行抗病鉴定表明,苗期中度感病,成株期抗性表现为阻碍白粉病在成株上的侵染、生长和繁殖,白粉病菌的侵染潜伏期被延长,产孢减少,表现为一种“慢白粉病”,并利用SSR-PCR在普通小麦与双二倍体回交后代中初步鉴定出一些小麦-加州野大麦异染色体系。本试验以加州野大麦及普通小麦中国春-加州野大麦双二倍体(2n=56)为材料,利用染色体C-分带结合FISH技术,对加州野大麦染色体进行核型、带型分析,为今后利用远缘杂交和染色体工程转移加州野大麦的有利基因奠定基础。1材料和方法1.1agri-brace国际培养模式供试材料为二倍体加州野大麦和普通小麦中国春-加州野大麦的双二倍体(TA3443),分别引自PlantGeneResourcesofCanada(PGRC),Agricul-tureandAgri-FoodCanada和WheatGeneticsRe-sourcesCenter,KansasStateUniversity,USA。1.2学习方法1.2.1染色体c-结带根尖细胞有丝分裂中期染色体制片制备以及C-分带程序参照Gill等和Friebe等的方法。1.2.2普通小麦中国春和玉米dna的标记和杂交C-分带制片照相后,脱色进行依次基因组荧光原位杂交,用荧光素Fluoresceint-12-dUTP分别标记普通小麦中国春总基因组DNA和来自玉米的45srDNA作为探针,杂交程序参照陈佩度等、Jiang等的方法。1.3fish的光波长检测染色体C-分带后仅选择分裂相好的染色体制片,滴加二甲苯,盖上22mm×22mm盖玻片,对目标细胞进行照相,记录相应细胞所在坐标。FISH的制片在OlympusBX60型荧光显微镜下用450～490nm激发光波长观察,用SPOTCCD(SpotChargeCoupledDevice)照相机摄取图像。利用ADOBEPHOTOSHOP7.0图像处理软件进行染色体的剪贴、排列和同源染色体的配对,测量染色体核型分析参数。1.4数码显微图像处理系统核型分析采用MoticChinaGroupCO.LTD提供的Moticimagesplus2.0ML软件“数码显微图像处理系统”,测量染色体的相对长度。核型按Levan的分类法和李懋学等植物染色体标准化的规定分析,核型分类根据Stebbins的核型分类标准,核型不对称系数参照Arano公式。2结果与分析2.1染色体核型及类型中国春-加州野大麦双二倍体进行根尖细胞染色体制片后,挑选分散良好、收缩适中、形态好的有丝分裂中期分裂相50个,镜检并统计染色体数目,并进行染色体C-分带和基因组荧光原位杂交,其结果如图1a-1b所示。参考Gill普通小麦“中国春”染色体标准带型,双二倍体56条染色体中的加州野大麦染色体表现与中国春染色体有不同的C-分带型特征,在染色体一端或两端显现较强的端带。为了进一步确认来自加州野大麦的14条染色体,在C-分带拍照后又对同一制片进行基因组荧光原位杂交,比较同一分裂相的C-分带带型和FISH图片可以准确直观识别出中国春-加州野大麦双二倍体中的14条加州野大麦染色体。利用数码显微图像处理软件系统测量加州野大麦染色体的相对长度,计算出染色体核型分析的参数和类型,并将加州野大麦7对染色体由长到短的顺序分别排列,依次定名为H1、H2、H3、H4、H5、H6和H7,建立了加州野大麦的核型模式图(图2)。根据Levan等的命名法则,确定了加州野大麦各对同源染色体的类型(表1)。加州野大麦的核型公式为10m(2SAT)+4sm;染色体相对长度变化范围为11.40～16.14,5对染色体的臂比值在1.0～1.7之间,属于m类型;2对染色体的臂比值在1.7～3.0之间,属于sm类型,最长染色体与最短染色体相对长度比为1.4,有臂比>2的染色体比例占14%,核型分类为ⅡA,属于较对称的类型(图2)。2.2染色体定位分析rDNA是高度保守的重复序列家族,拥有几百乃至几千个拷贝,成簇分布于一对或多对染色体上。通过荧光原位杂交(FISH)技术将rDNA在染色体上进行定位,可以为核型分析提供有效的细胞学标记,是核型分析的重要工具。45SrDNA的位点常常与随体染色体的数目是一致的。为明确加州野大麦染色体中的随体染色体的C-分带带型特征,以45SrDNA为探针对C分带染色体制片进行FISH杂交,结果显示,在图1b箭头所指的14条加州野大麦染色体中,只有2条染色体上有较强的杂交信号(图3),进而根据核型和C-分带带型确认出该染色体为最短的染色体H7。2.3不同臂比的长度和臂比分布根据染色体核型和带型特征,将双二倍体中加州野大麦的C-分带后的染色体进行剪切、同源染色体配对、排列,建立了加州野大麦染色体标准C-带带型图(图5)。H1:是最长的染色体,臂比近于1,长臂与短臂上各1条强末端带,短臂有弱中间带纹,未见明显着丝粒带;H2:臂比最大,长臂是短臂的近2.8倍,长臂上有强末端带及弱中间带纹,短臂无强端带,但有较强亚端带;H3:臂比约为1,短臂有很强的末端带及较强的着丝粒带,长臂上有弱近着丝粒带及弱中间带纹和弱端带;H4:臂比较大,长臂约为短臂的1.8倍,C带带纹最丰富,短臂较强末端带和弱中间带纹,有弱着丝粒带,长臂有丰富的中间带纹,近着丝粒带和较强亚末端带;H5:臂比近乎等于1,长臂与短臂各有一条强末端带,弱着丝粒带,短臂有很弱的中间带;H6:臂比大于1,短臂有强末端带,弱着丝粒带,长臂无强端带;H7:染色体最短,是1对随体的染色体,短臂有很弱末端带,长臂上强末端带。3讨论和结论3.1基因组织特点表3Levitzky和Stebbins认为,在被子植物中,核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展的,系统演化处于比较古老或原始的植物,大多具有较对称的核型,不对称的核型则主要见于衍生的、特化的以及进化的植物类群中。多年生加州野大麦的核型类型是较为对称的ⅡA型,在系统演化中属于比较原始的植物种类,与禾本科其它属的植物相比,加州野大麦比稻属(OryzaL.)原始,而与小麦属(TriticumL.)、黑麦属(SecaleL.)、狗尾草属(SetariaBeauv)及狼尾草属(PennisetumRich)等属的大多数种的进化程度相近,这可为研究多年生加州野大麦的起源、进化以及育种提供参考。高等植物45SrDNA是编码各种rRNA前体的基因,在转录过程中随后被剪接成为28S、18S和5S等3种rRNA(28SrDNA、18SrDNA和5SrDNA),其中18S与28SrDNA在基因组中的构成是一体的,即组成18S-28SrDNA,主要定位在核仁组织区(NuclearOrganizerRegion,简写为NOR),在染色体的次缢痕部位。NOR的数目一般与随体数目相对应,依赖45SrDNA杂交信号的有无结合染色体形态判断随体是比较准确的。rDNA虽然在序列上高度保守,在染色体上的物理位置具有固定性,但在物种进化过程中并非是一成不变的,即使在亲缘关系很近的种中甚至种内,rDNA位点在染色体上的位置、数目和拷贝数也可能有差异。Leitch等在栽培大麦(Hordeumvul-gareL.cv.Sultan)染色体上就检测到5对45SrDNA的FISH信号,它们分别位于第6、7、5、1和2染色体上;Brown等发现栽培大麦(ShinEbisu16)的45SrDNA的位点有2对,分别位于第6、7染色体(具随体);Taketa等通过对大麦属9个野生种及细胞型的研究,发现rDNA的定位为研究该属的核型进化、系统发育提供了非常有价值的信息。赵丽娟等对我国的栽培大麦45S和5SrDNA进行FISH定位发现,45SrDNA位点有2对,分别位于第1、2染色体(具随体),与Leitch等和Brown等的结果均不同,45SrDNA位点多位于着丝粒和短臂,位于长臂的情况较为少见。Lima-De-Faria曾分析了700多个种的NOR,发现87%的种中NOR位于染色体的短臂上。Lim等猜测rDNA位点在染色体上的这种位置特点可能与其功能有关,是某种分子或物理上的制约作用使染色体臂可以与核仁相联。本试验45SrDNA-FISH的结果显示,加州野大麦显示的信号位点只有一对,也位于第7染色体的短臂上(具随体),加州野大麦(Acession:CN26882)的45SrDNA位点位于H7染色体短臂近着丝粒处,与Taketa以加州野大麦(Acession:H3317)为材料的研究结果一致,而双二倍体中的加州野大麦45SrDNA位点位于H7染色体短臂近端部,推测双二倍体中加州野大麦品系不是CN26882或H3317。进一步对引进的二倍体加州野大麦进行根尖体细胞染色体依次C-分带及FISH,以确定中国春-加州野大麦双二倍体中是否有未检出的NOR位点。统计近20个细胞(包括有丝分裂中期与间期)发现,二倍体加州野大麦中也只有1对随体染色体,这与双二倍体中的研究结果一致(图4)。研究还发现,在本试验所用的双二倍体和二倍体加州野大麦中,尽管该NOR位点都位于最短的H7染色体上,但双二倍体中位于H7染色体短臂近端部,而二倍体中则位于短臂近着丝粒位置,推测是由于双二倍体中所用的加州野大麦与本试验所用的二倍体来源不同,属于不同品系。加州野大麦各染色体的主要特征描述如下:核型分析是对一个物种进行细胞遗传学研究的基础。许多研究者认为,小麦族内物种的形成可能是在二倍体的水平上由于染色体上结构的重排和突变形成的,Oinuma也认为物种的核型与基因组之间存在平行进化的关系,因而通过核型分析,可以部分地了解物种之间的亲缘关系。生物核型内的一些形态特征,如染色体的长度、臂比、随体的有无等,还可以用来鉴定某一物种内的特定染色体。但在对一些染色体形态不规则的物种进行核型分析时,仅仅依靠其染色体的长度和臂比特征进行配对分析很难得到准确的结果。植物染色体的C-分带主要显示染色体上的组成型异染色质,它们主要由分布在染色体末端和着丝粒附近的DNA重复序列组成。本试验结合Giemsa-C分带技术,对加州野大麦根尖细胞有丝分裂中期染色体进行核型分析,克服了传统核型分析中染色体区分难的缺点,更加直观、快捷而准确地获得植物