小麦染色体c-分带技术的研究进展

小麦染色体c-分带技术的研究进展

1异染色质的浓缩程度染色带是一种用特定的染色过程中对染色带的染色，具有不同的深度。生物细胞中有常染色质和异染色质之分,在细胞分裂过程中,异染色质的浓缩程度要比常染色质的浓缩程度高。在染色体分带中,经酸、碱、酶或高温的处理后,DNA变性双链打开,由于异染色质区的复性速度快,易于染料结合染色较深,而常染色质复性慢,结构松散染色较浅,从而在染色体上出现深浅不一的带纹。特定染色体有特定的带纹,因此分带技术可作为鉴别染色体组和单个染色体的手段,从而可以深入认识染色体结构成分和遗传的关系。1.1小麦染色体中c-分带染色体分带技术中最初的显带是荧光显带,上世纪60年代末发明了Q显带技术,它是将植物染色体经芥子奎吖因(quinacrinemustard)处理后,在荧光显微镜下形成明暗不同的带纹。1973年发明了另一种荧光显带技术,Hoechst33258显带,其原理主要是基于染料分子与DNA分子中的碱基作用,从而显带。1970年,Fardue和Gall在研究中发现染色体着丝粒区可特殊显带,1971年Arrighi等在此基础上建立了GiemsaC-分带技术。Giemsa显带最早是在1970年应用在哺乳动物染色体上,1972年以后应用在植物方面。1974年Gill和Kimber最先报导了黑麦染色体上的C-分带技术。随着制片技术的发展,分带技术也在不断改进和完善,C-分带技术已应用于很多植物,尤其是麦属植物中研究较为深入。研究表明,小麦染色体C-分带带型比较稳定,并且重复性好。杨瑞武等利用改良的C-分带技术分析了矮杆波兰小麦的染色体带型,发现在非同源染色体之间,带型的数量、大小、强弱及其分布情况存在明显差异。荧光显带也应用到很多植物中,并且其操作简单,与其它的分带技术存在异同。Liu等发展的DAPI荧光显带技术在染色体未经化学处理的情况下,直接用DAPI进行染色,在植物染色体上显示出类似与Q-带的丰富带纹,且带纹稳定,无论是大基因组还是小基因组都能够很好地显示出带纹。陈建民等对苜蓿染色体荧光分带时发现DAPI带型的数目和位置与C-带基本相似,两个二倍体的DAPI带型明显不同。1.2荧光显带是检测dna结合能力的依据植物染色体GiemsaC-分带是染色体经过一定的酸、碱、酶或高温处理后用Gimesa染料染色,使染色体在特定位置上出现深浅不一的带纹,它是对染色体的结构异染色质区域染色。C-分带是植物染色体研究中应用最为广泛的一种分带方法,主要用于染色体的鉴别和核型分析,同时为物种亲缘关系的鉴定提供依据。荧光显带是是根据荧光染料与DNA中AT、CG碱基结合能力的不同而在染色体上显示出带纹。如DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole,即4,6-二-2-苯基吲哚)、DA远霉素(DistamycinA)等与AT碱基特异结合,CMA色霉素(ChromomycinA3)、AMD即放线菌素D(ActinomycinD)等特异性与CG碱基结合,利用这种特异性的结合使染色体上不同部位出现荧光带纹。荧光显带反映了染色体中DNA碱基组成的不同和变化。但有学者研究表明在局部环境下蛋白质可能会影响染料与DNA的结合能力,同时也可能对荧光的激发和散射产生影响。GiemsaC-分带技术在开创以来最先是在动物细胞学研究方面应用的比较多,随着技术的不断改进和完善,如今已经被广泛应用到植物研究中,而且被应用到的植物种类越来越多,技术和方法也越来越成熟,它在植物研究领域的应用主要有以下几个方面。1.2.1小麦染色体核型以往进行的核型分析只能根据染色体的形态特征(长度、臂比、缢痕、随体等)进行区分,这种常规的分析方法有其自身的局限性,不能将物种的染色体一一区分开来。应用分带技术进行植物染色体核型分析可以克服这些缺点,能够更加准确区分染色体,准确分析核型,从而为深入研究物种起源和遗传关系等提供重要的细胞学资料。以研究最多的麦属为例,普通小麦的染色体大小和臂比相近,常规方法难以区分,Gill等最早对小麦进行了C-分带,对其染色体进行了区分。Endo等又用改进的分带方法对普通小麦分析,结果除了1A外的所有染色体都显示出特异带纹,使得各个染色体都能清楚辨认。目前对于研究最多的黑麦来讲,其染色体C带核型特征已经被确定。吴金华等对奥地利黑麦进行C-分带染色体核型分析发现,除了2R和4R长臂近端部约1/4处有带且7R无中间带外,其余带型与黑麦标准C-分带带型基本一致。刘光欣等对8个大赖草材料进行了C-分带研究,结果发现大部分染色体都显示较强的末端带,着丝粒带和中间带则不丰富。1.2.2小麦染色体易位鉴定由于不同物种的染色体显带不同,因此已将C-分带技术应用于植物远缘杂交和染色体工程研究细胞学鉴定中。Gill和Kimber1974年首次利用C-分带技术识别小麦的染色体易位,鉴别出6B/4A、1R/1D这类整臂易位类型。Gustafson等于1983年用C-分带方法鉴定出小麦-黑麦的易位系,由带纹的变化鉴定出大麦1RS染色体易位到小麦1AL、1BL上,但无法找到易位点,易位长度也无法估计。Darvery和Gustafson(1975)将C-分带技术用于识别小麦-黑麦异附加系中的黑麦染色体,成功地识别了1R、3R、4R、5R和7R,而2R仅在某些品系中得以识别。1.2.3倍体的起源多倍体现象在生物界非常普遍,而且多倍化也是物种进化和形成的重要途径之一。通过对植物染色体进行分带,研究染色体形态和特征,可以用于探讨多倍体植物的起源。Linde通过染色体带纹相似性的比较,发现大麦属的异源四倍体Hordeumreshevitzii(4x)可能是由H.reshecitxzii(2x)与H.califormicum(2x)相近种杂交形成。高云红等对节节麦-黑麦双二倍体以及亲本节节麦、黑麦进行C-分带研究,结果显示节节麦-黑麦双二倍体的C-带带型与亲本的基本相同,说明该双二倍体含有双亲的完整的染色体组,从而在细胞学水平上证实了该多倍体种质的来源。2fish的应用荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是一项分子生物学与细胞学相结合的技术,目前在植物研究中的应用较为广泛。它是用特异性的核酸重复序列作为探针,用一定方法将其进行荧光标记,然后与被测目标进行杂交,通过荧光显微镜下可以观察到特异的荧光信号,从而对其进行分析处理。2.1精确定位杂交1969年Gall和Pardue最先用放射性标记的RNA探针定位特定的靶DNA序列,从而开创了RNA-DNA原位杂交技术。他们利用同位素标记的DNA探针对非洲爪蟾的核内rDNA在细胞制片上进行检测。由于同位素探针的高背景缺陷,限制了它对靶序列的精确定位。在原位杂交技术的开创初期,都是采用放射性同位素标记探针,需要用放射性自显影进行检测,这种检测上的限制和当时分子克隆技术的缺乏使得它不能得到广泛的应用。因此在随后的研究中,人们主要是在标记方法和探针类型方面进行改良和探索。1975年,Manning等最先在分子杂交中使用非放射性标记,用细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。1977年,Rudkin发明了用间接免疫荧光检测目的DNA的非同位素原位杂交(Nonisotopicinsituhybridization,NISH)。1981年,Langer等首次采用生物素标记的核酸探针成功地进行了染色体原位杂交。至此,以荧光标记探针进行基因原位杂交的技术趋于成熟。这项技术于1985年由Rayburn开始应用于植物研究中,并不断发展和完善,目前,该技术已应用到植物研究的很多领域。2.2荧光杂交检测荧光原位杂交技术的基本原理是在核酸碱基互补配对原则的基础上,利用一定的物理或化学方法对核酸处理使其变性,用荧光染料标记的核酸探针(DNA或者RNA序列)与染色体或DNA纤维上变性后的单链序列互补配对,从而杂交在一起,然后用与荧光分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合,通过一定的检测手段将荧光杂交信号在染色体或者DNA纤维上定位和分析。2.3异的探针序列随着荧光原位杂交技术的不断发展,特异的探针序列作为该技术中的一个关键,针对不同植物和不同的研究目的也有很多的改进,主要是探针类型和标记方法。2.3.1fps系统探针针对不同的研究对象或者目的,荧光原位杂交技术中的探针大致有以下几种。(1)染色体特异性重复序列探针:在特异染色体类型上重复元件可达106拷贝数,rRNA基因、端粒重复序列、着丝粒重复序列以及类似于α卫星、卫星Ⅲ类等都已经被克隆,而且这种探针一般对应的靶序列大于1Mb,与靶位点紧密结合形成高度浓缩的区域,因此易于检测,它通常用于快速检测染色体非整倍体,如单体和三倍体。(2)单拷贝序列探针:此类探针针对基因组中单拷贝或者低拷贝的序列,通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大的插入片段,如柯斯质粒或酵母人工染色体标记。这些序列可以来自质粒、粘粒、噬菌体PI载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体克隆等。目前已经有小到含有2kb目标序列的质粒探针用于FISH,然而由于杂交位点检测率随着探针大小的降低而降低,所以其杂交效率很小(20%-50%)。(3)总基因组探针:高等物种的基因组中含非常多的重复序列,而真正编码的DNA序列只占很小的比例,而这些高中度重复序列的不同也代表了物种的特异性,然而并非所有的重复序列都有物种特异性,因此,利用某一物种的总基因组DNA作为探针,与另一物种的染色体进行原位杂交,可用于分析异源多倍体基因组组成、起源、进化和其亲缘关系。(4)染色体文库探针:由基因组DNA文库中分离出的某一条或某一区域的核酸片段组成,可由克隆到噬菌体和粘质粒上的染色体特异性大片段插入文库制取,且此种探针片段小,与相邻区域发生重叠及制片过程中被破坏的可能性小。这类探针可用于中期染色体重组和间期核结构分析,以及鉴定染色体的异位和畸变等。(5)RNA探针:RNA探针主要用于RNA的原位杂交技术中。主要包括ssRNA探针和寡核苷酸RNA探针两种,其中单链反义RNA探针广泛应用于组织切片和整体制备物上。由于RNA原位杂交是探针与细胞内的特定mRNA杂交,故RNA探针的敏感性更强,不需要变性,它与目标RNA形成的杂交体比DNA探针的更紧密,同时,它可用于鉴别一些特定序列如两个相关密切的同源性mRNA(同型mRNA)。RNA探针比DNA探针更加具有优越性,尤其是有义链可作为非特异性杂交的背景对照,因此它的应用在RNA原位杂交中最为广泛。2.3.2间接法与半抗原标记方法比较在探针的标记方法方面,FISH的探针标记是由最初的放射性标记方法发展而来的。放射性标记方法虽然要求不高,且具有较高的灵敏度,但是其信号分析比较困难,又有放射性危害,所以逐渐被非放射性标记所取代。FISH的标记方法可分为直接法和间接法两种。直接法是将荧光物直接标记到核苷酸上,杂交后可被检测到,而间接法是先在DNA探针上接半抗原,镜检前再用与半抗原特异结合的蛋白质进行检测。直接法虽然操作简单,干扰少,但是它得到的荧光信号不能被放大处理,因而灵敏度相对较低。直接法中常用的与核苷酸直接结合的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗明达衍生物(TRITC)、氨甲基香豆素醋酸酯(AMCA)等。在间接法中常用的半抗原为生物素和地高辛。其标记方法有很多如缺口平移法、随机引物法、PCR或RNA体外转录法,标记长度一般为200-400bp。生物素是最早用到的中间标记物,与生物素结合的核苷酸探针可用结合有荧光素的亲和素(avidin)和链亲和素(streptavidin)检测。由于在原核生物和真核生物中普遍存在着内源性生物素的干扰,抗生物素蛋白对非流动性基质存在非特异性结合,因此提高了标记成本,降低了灵敏度,于是后来发展了以地高辛标记。地高辛标记的探针可用连有荧光素的抗地高辛抗体检测,由于它灵敏度高,因此得到广泛的应用。2.4dna的分离纯化在荧光原位杂交中针对不同的研究对象和目的与探针杂交的靶也有不同的类型。(1)中期染色体:最早应用以及应用最普遍的靶就是中期染色体。由于在细胞有丝分裂中期的染色体可以用传统的染色体制片技术获得,而且可以非常清晰地观察到单条染色体。随着染色体制片技术的逐渐发展和成熟,以中期染色体为探针的靶序列进行原位杂交分析就更加简单,也使得原位杂交的技术应用范围更加广泛。但由于中期染色体高度浓缩,因此分辨率相对较低。(2)间期细胞核:相对中期的染色体来说间期的细胞核中的染色质浓缩程度要低很多,因此其原位杂交的分辨率要比分裂期高。但由于细胞核本身具有一定的空间结构使得分辨率在50kb左右,要突破这个限度就需要打破其原有的结构,并且间期的细胞核不具有染色体结构,在应用范围上也受到了一定的限制。(3)游离染色质:前面提到为了提高分辨率要打破细胞核的原有结构,因此有人提出,用碱性溶胞剂(alkalinelysisbuffer)对处于G1和G2期之间的间期细胞核进行处理,释放出游离的染色质丝,人为地改变其结构,使得其中DNA的浓缩程度进一步降低。试验结果表明,这种方法能够使分辨率接近10kb,能够分析1Mb范围内的DNA序列的位置关系。(4)DNA纤维:DNA纤维作靶是将单细胞的悬浮液涂抹在载玻片上,然后用碱性变性剂将染色体结构破坏,使DNA分子与复合的蛋白质分离开来,这样就形成了游离的DNA纤维,因此杂交后的信号不再是单个的点,而是许多点组成的线,通过测量信号的长度能够估计出探针分子的长度。这种以DNA纤维为靶与探针杂交的方法具有快速、直接和简便的优点,在1Mb的DNA范围内,其分辨率能达到1-2kb,但其不足之处在于不能阐明靶序列相对于着丝粒、端粒和异染色质块等染色体标记的位置和取向,如果没有已知位置的DNA标记的共定位则不能鉴别染色体。2.5原聚光刻技术的应用2.5.1荧光原位杂交技术在物种亲缘关系的鉴定方面,在核型分析的基础上,通过对基因组的整体分析检测可以更加明确地对其进化关系进行比较。以分带技术的染色体核型进行对比,并且结合原位杂交技术,用特异重复DNA序列作为探针进行原位杂交,为研究相关类群之间的基因组关系,鉴定体细胞杂种间的亲本基因组提供了一种可选择的途径。Schwarzacher等用非洲黑麦(Secaleafricanum)的基因组DNA作探针,与杂种(Secaleafricanum×Hordeumchilense)的根尖染色体杂交,发现有7条大的染色体来自于非洲黑麦,另外7条则来自于H.chilense。同时,还在间期细胞核中发现不同来源的基因组在细胞核中不是随机混合的,而是各自占据了一个确定的区域。Uozu等以O.australiensis特异重复序列RIRE1作探针,用荧光原位杂交技术对O.sativa×O.australiensis的回交后代进行检测,十分清楚地区别出后代25条染色体中12条来自O.sativa,13条来自O.australiensis。其次,荧光原位杂交技术在同源和异源多倍体的研究中得到很好地应用。多倍体物种在自然界广泛存在,鉴别它们的供体基因组及外源染色体是亲缘关系研究的重要方面。传统的染色体水平的研究是根据核型和分带特征来推测不同物种之间的演化关系,但是在一些时候,这些特征数据常常不稳定,一些属的植物之间核型较相似,难以提供识别供体基因组的有效依据,如菊属,而植物染色体的分带技术在目前也没能做到像分析人类染色体带型那样稳定、清楚。染色体原位杂交从理论上来说可以解决上述问题。自Schwarzacher用GISH的方法在杂种中鉴别出供体基因组以后,已在许多的作物及野生植物中得到应用。燕麦(Avenasativa)是一个典型的异源多倍体种,传统的核型分析和减数分裂染色体配对行为的观察认为,它是由AACCDD基因组组成。A和C分别来源于A.strigosa和A.ventricosa,剩下的即为D组,但不知来源于哪个二倍体种。分别用A.strigosa和A.pilosa的总DNA作探针进行基因组原位杂交,结果表明,A.pilosa标记了C组,A.strigosa标记了A和D组,进一步研究表明,A组和D组的同源性要较C组的高。亲缘关系研究中还常根据杂种减数分裂时的染色体配对行为来判断基因组的来源,但是当这种杂交由于某种原因而失败时,原位杂交就提供了一种有效的手段。Miliummontianum(2n=22)是一个典型的二型核型种,由8条大的染色体(L-)和14条较小的染色体(S-)组成。核型分析肯定了S-的来源,但无法确定L-是否来源于M.vernale(2n=8)或其近缘种。二倍体的M.vernale无法和M.montianum杂交,也不能用减数分裂时染色体配对行为来分析L-染色体是否来源于M.vernale。当以M.vernale的总DNA为探针进行原位杂交,在M.montianum的根尖细胞中发现所有的L-染色体均显示了杂交信号,而S-染色体没有信号,这就确定了异源四倍体种M.montianum的L-染色体来源于M.vernale或其近缘种。在小麦属中,Liu等对不同的小麦类型和普通小麦进行显带比较和原位杂交分析,在其起源和进化上也得到很好的分析结果。2.5.2种植物叶片原位杂交分析结果荧光原位杂交技术被广泛地应用于植物特定的基因定位中。目前研究较多的是植物基因组中核糖体基因5SrDNA,25SrDNA,45SrDNA等在染色体上的定位。马有志等以黑麦品种Petkus的细胞核为模板,扩增了45SrDNA基因中的18SrDNA基因,并以其为探针,采用荧光原位杂交技术,将45SrDNA基因定位在了染色体1R的1RS1.3处附近(即随体附近)。廖进秋等以45SrDNA和5SrDNA基因为探针对波兰小麦和矮兰麦进行了荧光原位杂交分析,结果表明,高杆波兰小麦、矮杆波兰小麦和矮兰麦的45SrDNA基因位点高度一致,都在随体染色体短臂的核仁组织区(NOR)显示出4个位点,5SrDNA基因在高杆波兰小麦和矮兰麦染色体上表现一致,都显示出6个基因位点,而在矮杆波兰小麦中显示出8个,较前两种多出2个基因位点,且独立于一对染色体短臂上。王岚对诱导的多倍体新麦草进行原位杂交分析发现,新麦草基因组中主要在3对染色体上具有45SrDNA位点,分别位于第Ⅰ、第Ⅲ和第Ⅴ染色体短臂末端,初步推测是NOR染色体。目前,还分别在火柴头(又称竹叶菜、饭包菜、兰姑草)、苜蓿、加州野生麦、百合、沙田柚等植物上实现了45SrDNA基因的定位。另外,对于一些植物存在一定的如抗病,抗旱等良好的抗逆性状,这些性状都是由其一定的抗性基因决定的。因此如能够将这些特定的抗性基因进行定位分析,并将其提取出来,再利用基因工程的手段对基因进行克隆杂交,从而可以在植物育种中有极大的帮助,使得得到具有良好抗性的新的杂种后代成为可能。如今很多抗性基因已经在许多植物中定位出来,如王金平等对小滨麦易位系小麦山农0096进行抗条锈病基因的定位研究,将导入的抗条锈病基因定位在了4A染色体上。钟筱波等用生物素标记的Arabidopsisthaliana端粒重复序列探针PatT4和地高辛标记的番茄端粒联接重复序列TGR1对番茄进行荧光原位杂交,结果发现PatP4探针杂交到所有番茄染色体端粒上,TGR1只杂交在24个端粒中的20个上,其中第1、2、7条染色体的长臂和第2条染色体的断臂不含TGR1序列。2.5.3小黑麦普通小麦的分子检测利用荧光原位杂交技术与分带技术结合能够对于植物中的易位系做到更加全面的鉴定,没有易位片段的长度的限制。石云素等用FISH技术检测了小麦背景中的1B/1R易位。他们以黑麦总基因组DNA做探针,检测了小黑麦×普通小麦的3个衍生系930553、930560、930612的黑麦染色质,发现都有1RS染色体臂与一小麦染色体臂发生易位,且断点在着丝点附近。元增军等对小麦和黑麦的易位系杂交后代(1RS-1RL与6VS-6AL易位系杂交)用C-分带和双色荧光原位杂交技术进行了鉴定,在F2中鉴定出小麦-黑麦-簇毛麦双重易位纯合体,且证实该易位系具有良好的细胞学稳定性,从而得到了有正常育性,有良好的农艺性和白粉病抗性的易位系。2.5.4书生基因整合随着现代基因工程技术的发展,转基因植物不断增多,FISH技术不仅能用于检测外源基因是否存在,而且还能将外源基因直接定位在染色体的相应位置并确定其拷贝数,同时也是转基因植株的遗传不稳定性、细胞基因表达和调控机理的重要研究手段之一。金危危等利用荧光原位杂交,在供试8个转基因水稻株系的染色体上检出了转入的外源基因barnase-psI片段,其中两株系各检出了两个不同的信号位点,而其他株系均只检出一个信号位点,所有染色体着丝粒区都没有杂交信号。结合Southern杂交及表达分析发现,大多数株系中,整合在染色体端部区的barnase-psI基因表现为高水平表达,而靠近着丝粒区的则表现为低水平表达,表明表达水平与转基因整合位置可能一定程度的相关性,表达水平与拷贝数无明显相关。Jin等利用荧光原位杂交技术检测并定位了转入水稻中的杀虫蛋白基因,杂交信号分散于距着丝粒26.2-95.2之间。Wang等利用该技术研究了转基因矮牵牛中T-DNA的插入位置,发现T-DNA大部分整合在着丝粒远端常染色质区。Pedersen等利用FISH技术找到了T-DNA在转基因大麦、小麦和小黑麦染色体上优先整合的位点,整合趋向于染色体的远端区。大量的FISH研究表明,外源基因在染色体上的整合不是随机的,而是优先整合到染色体的远端区。FISH技术特别是Fiber-FISH技术还可以显示转基因位点的结构。目前的研究表明,小麦中外源基因可能有3种插入形式,分别为串联重复整合、串联重复拷贝之间夹杂着基因组和单个转基因拷贝。有报道根癌农杆菌转化中外源基因的插入位点数少,一般只有1个,而基因枪转化中可看到1个以上的外源基因插入位点。鉴于转基因植物的遗传不稳定性,整合位点与其表达有关,对于整合位点的确定对于稳定的表达具有一定的意义。FISH技术在基因工程方面的应用结合C-分带技术,使得操作起来更加全面准确,因为在这方面的要求比较高的灵敏度和精确度。Schwarzacher等(1992)在小麦中定位了外源染色体、染色体片段和染色体的结构变异等。Cuadrado等(1996)采用C-分带原位杂交技术,成功地鉴定了小麦中黑麦基因的遗传渗透。2.5.5小麦染色体的检测在对许多植物的染色体核型分析研究中,仅仅靠外部形态结构很难对各条染色体进行精密的分析,尤其对于一些染色体外型比较单一,而且非常细小的植物更是如此。随着染色体分带技术和FISH的发展,利用C-分带和FISH技术相