基于荧光原位杂交技术的分子生物技术在污水生物处理系统中硝化菌群研究中的应用

基于荧光原位杂交技术的分子生物技术在污水生物处理系统中硝化菌群研究中的应用

在废水生物处理系统中的微生物研究是废水生物处理最基本、最重要的内容，也是废水生物处理系统高效、稳定运行的保障。传统的微生物研究方法依赖纯培养技术来分离细菌。该方法对研究废水生物处理系统中的微生物系统存在严重缺陷。首先，废水生物处理系统中的微生物群由各种微生物组成，具有一定的空间分布。这些微生物相互依存、竞争，并有复杂的序列关系。通过分离和培养细菌，我们无法获得在自然条件下获得微生物群结构和空间分布信息的微生物。其次，由于微生物遗传和代谢活动的巨大影响，细菌的分离和栽培改变了微生物的生理特征和生化特征，这降低了实际工程实践的重要性。此外，纯培养需要很长的时间，有些菌株（如亚硝酸盐氧化菌的nitoshun）不能通过纯培养技术进行纯分离。近年来,分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供了新的分析方法和手段.污水生物脱氮包括硝化和反硝化两大阶段.其中硝化菌群是硝化阶段的功能微生物,包括将NH4+-N氧化为NO2--N的氨氧化菌(Ammoniaoxidizingbacteria,AOB)和将NO2--N氧化为NO3--N的亚硝酸盐氧化菌(Nitriteoxidizingbacteria,NOB).AOB和NOB在污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性,是保证污水生物脱氮系统稳定运行的关键因素之一.因此,采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下的AOB和NOB的菌群结构、活性等进行研究分析,能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障.目前,以FISH和PCR为代表的分子生物技术已广泛应用于污水生物处理系统内硝化菌群结构和生物活性的研究中,国外已有大量的相关文献报道,但在国内还处于起步研究阶段.1在环境生物原位分析中的应用FISH技术是根据目标微生物16SrRNA基因中的特异性序列,设计相应的、带有荧光染料的寡核苷酸探针,按照碱基序列互补原则,将探针直接原位杂交到目的基因上,杂交成功的探针就会产生荧光信号.然后通过共聚焦激光扫描显微镜(Confocallaserscanningmicroscopy,CLSM)或者荧光显微镜对目的基因进行定性和相对定量分析.典型的FISH图片如图1所示.通过选取系统发育中保守性不同的特异性序列,就可在种、属水平上对微生物进行检测.因此,FISH技术还可用于研究微生物种群的结构动态变化.自从Amann等最初将FISH应用于环境微生物的原位分析以来,该方法已被用于污水生物处理系统内丝状菌、聚磷菌、硝化菌[4~5]、厌氧氨氧化菌等的原位检测.近几年,研究者在普通FISH的基础上发展了几种更为先进的分子生物学分析方法,用于对污水生物处理系统内硝化菌群的研究:FISH-MAR(Microautoradiography,显微放射自显影)技术、FISH-microelectrodes(Microelectrodes,微电极)技术和Clone-FISH技术.1.1fish-ro显微检测单独采用FISH技术,并不能获取微生物种群的生物代谢活性和生理功能的信息.而单独采用MAR技术,却无法对微生物种群的组成及其分布加以识别.Lee等首先将这两种技术结合,建立了FISH-MAR方法.该方法能够以显微照片的形式,清晰、直观地显示出复杂的微生物群体的菌群结构及其原位空间分布情况,而且同时能够反映出不同微生物种群的生物代谢活性.该方法的基本流程可总结如图2,其核心思想是将待分析的微生物样本放置在经放射性物质标记的有机或无机底物中进行培养,其中能够吸收放射性底物的细胞将在放射自显影的显微图片上呈现黑色的影像(MAR阳性,MAR+),而没有吸收放射性底物的细胞则没有影像显示.对于异养型微生物通常采用14C标记的有机底物,如14C-乙酸;对于无机自养型硝化细菌,通常采用NaH14CO3.图3为一典型的Fish-MAR显微图片,图中的黑色细胞为吸收了NaH14CO3的化能自养型细菌,红色细胞为通过FISH探针检测到的AOB,二者的细胞数比例表示化能自养型细菌中AOB所占的比例;绿色细胞是FISH探针检测到的NOB.Okabe课题组采用FISH-MAR方法对自养型硝化生物膜中的微生物代谢进行了研究.研究者首先将自养型硝化生物膜在含有NaH14CO3的底物中培养6h,其中自养硝化菌呈MAR+,异养菌呈MAR-.再将含MAR+硝化菌和MAR-异养菌的生物膜在仅含有NH4+的溶液中培养10d,结果发现多数异养菌呈现MAR+,说明异养菌能够利用14C标记的硝化菌细胞裂解产物或代谢产物,从而揭示了在碳源受限的自养型硝化生物膜中微生物在底物利用上的相互作用关系[8~9].该研究指出在碳源受限的硝化生物膜中硝化菌与异养菌各占50%,其中α-Proteobacteria23%、γ-Proteobacteria13%、绿色非硫细菌9%、CytophagaFlavobacteriumBacteroides2%、不能确定的微生物3%.Gieseke等也采用FISH-MAR方法对生物膜中的硝化及碳源同化进行了原位分析,进而研究不同微生物种群之间碳的转化及同化.虽然FISH-MAR是一种研究微生物代谢及微生物种群结构的有效方法,但该方法不适于检测目标微生物含量较低的样品.由于其检测手段取决于目标微生物的荧光信号和放射自显影,所以当活性污泥中目标微生物的细胞数低于104cell/mL时,由于目标微生物的rRNA含量过低,将导致无法区分目标微生物与背景的荧光信号,从而造成无法检测.所以,当硝化菌群没有成为系统的优势菌群时FISH-MAR将难以取得检测结果.1.2生物pcr检测自养型硝化膜和处理市政污水的生物系统和生物资利用微电极技术能够检测活性污泥絮体或生物膜内部微小生境的环境要素,并通过这些环境要素的变化反映微生物代谢活性.FISH-microelectrodes方法将FISH技术和微电极技术二者有机地结合在一起,该方法能够建立微生物原位空间分布、代谢活性与环境要素之间的相互关系.其中微电极能够测量的参数主要有O2、H2S、NO3-、NO2-、NH4+和pH等.目前FISH-microelectrodes技术主要集中应用在对生物膜中微生物种群的研究.其中对于具有硝化功能的生物膜,该方法能够确定沿着生物膜厚度的垂直方向硝化菌群的原位分布及代谢活性[12~13].Okabe课题组采用该方法研究了自养型硝化生物膜和处理市政污水的生物膜中AOB和NOB的原位空间分布.结果表明这两种生物膜系统中Nitrosomonas是优势AOB,Nitrospira-like是优势NOB,没有检测到Nitrobacter.Nitrosomonas遍布整个生物膜,而Nitrospira-like以细胞聚集体的形式分布在AOB周围.该生物膜的氨氧化区主要集中在生物膜的外层,亚硝酸盐氧化区位于氨氧化区下面.采用FISH-microelectrodes方法也能够很好地评价生物扩增和生物刺激对生物膜系统硝化功能的影响,其中FISH用于分析硝化菌群时间上的动态变化,微电极测量反映原位硝化活性.生物扩增是将富集培养的硝化菌投加于系统中,该方法能够提高系统内硝化菌活性及丰度,从而快速启动系统的硝化功能.生物刺激是通过提高或投加某种底物,从而促进或抑制微生物的生长.有研究者试图提高硝化系统启动阶段的底物中NH4+和NO2-浓度,想藉此来刺激AOB和NOB的生长,但实验结果表明该操作并没有加快系统硝化功能的启动,其中NO2-氧化过程并没有受到影响,但是AOB增殖却到了受抑制.也有研究者采用FISH-microelectrodes方法研究活性污泥系统中反硝化作用与硫酸盐还原作用的相互影响,反硝化菌与硫酸盐还原菌对有机碳源的竞争.1.3clwell-fish的实验由于含有目的基因片段的克隆子(Clones)同样适用于FISH检测,因此诞生了Clone-FISH检测方法,即采用FISH筛选阳性Clones或检验探针的有效性.Clone-FISH的实验程序总结如图4.目前将Clone-FISH方法直接用于硝化菌群的研究鲜有报道.该方法的应用主要体现在两方面:一是检验针对硝化菌群的探针的特异性和有效性.探针是FISH应用的前提和基础,以16SrRNA克隆子代替纯培养的细胞作为阳性对照检验探针的特异性及优化杂交条件,尤其是当某些硝化菌群无法进行纯培养时,Clone-FISH解决了检验探针特异性的难题.二是用FISH筛选克隆文库中的阳性克隆子,检验目的基因片段是否成功转化.2基于pcr技术的衍生法PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的分子生物技术.PCR技术解决了从环境样品中提取的硝化菌DNA含量通常过低而不能进行相关分析的难题.目前多种基于PCR技术的衍生技术已经广泛应用于对污水生物处理系统内硝化菌群的研究,并取得了大量研究成果,深化了人们对硝化菌群的认识.2.1不同菌株的16srrna基因差异将PCR技术应用于对硝化菌群的研究中,首先要选取一段具有硝化菌群系统进化标记特征的DNA序列作为目的分析序列,然后根据该序列的保守区设计相应的探针和引物.其中,对AOB进行研究分析时所选取的分子标记基因一般是AOB的16SrRNA基因和amoA.对16SrRNA基因的研究给整个分子生物学研究领域带来了革命性的影响,并扩展了人们对微生物系统发育的认知.16SrRNA基因具有高度的保守性,但不同微生物的16SrRNA基因的某些区域也存在着差异.这些差异可将微生物分为古细菌和细菌两大类,并能在分类学上对微生物进行更进一步的研究.伯杰氏系统细菌学手册的第2版中对微生物的分类和命名就是基于对不同微生物16SrRNA基因差异的分析.同样不同种AOB的16SrRNA基因在结构上也具有差异性.依据16SrRNA基因的保守性和差异性,可确定不同种AOB的系统发育的相关性和进化距离.所有种类AOB的基因组中只含有一条16SrRNA基因.amoA是编码氨单加氧酶(Ammoniamonooxygenase,AMO)的基因,AMO是AOB所特有的一种胞内酶.编码AMO的基因簇中至少含有3个基因:amoA、amoB和amoC.其中amoA的基因产物包含AMO的活性位点,可以催化铵氧化成羟胺,并为AOB生长提供能量.不同种类的AOB含有不同拷贝数的amoA,一般AOB中含有2~3个拷贝数的amoA.Nitrosomonaseuropaea中含有2个拷贝的amoA,这2个拷贝的amoA的DNA序列上仅有一个核苷酸不同.Hommes通过突变实验证明这2个拷贝的amoA都是功能基因,但是它们在细胞内的功能和地位却不尽相同.Purkhold、Aakra和Nicolaisen等对不同AOB菌株的amoA和16SrRNA基因进行测序和系统发育树分析后,发现大部分AOB在分别基于amoA和16SrRNA基因的系统发育树上的分类有着高度的相似性.他们同时也发现,尽管对AOB的16SrRNA基因和amoA基因进行定性分析时都可以反映出环境中AOB的种类,但由于不同种AOB之间的16SrRNA基因序列的高度相似性和该类型引物的非特异性,限制了16SrRNA基因类引物对AOB菌群系统发育树分析的精确度.而尽管amoA不是制定系统发育树的因子,但由于amoA只存在于AOB中,而且不同种AOB的amoA序列差异度超过其16SrRNA基因的序列差异度,使得amoA类引物的扩增特异性更强,因此对AOB菌群遗传差异的分辨能力更高,从而能够更精确地分辩出AOB的种属.但无论是amoA类引物,还是16SrRNA基因类引物,目前都只针对β-变形菌纲的自养型AOB,因此在使用这两类引物对AOB进行分析研究时都会低估环境样品中AOB菌群的多样性.2.2pcr-dlling-sequeng技术PCR-DGGE(PCR-denaturinggradientgelelectrophoresis,PCR-变性梯度凝胶电泳)技术是将PCR扩增产物加入到含有线性梯度变性剂(尿素和甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳.PCR扩增出来的DNA片段长度虽然相同,但是它们的碱基序列却不尽相同.在电泳过程中,序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性,导致其在聚丙烯酰胺凝胶中电泳速度的急剧下降,从而停留在其相应的变性剂梯度位置上.再通过染色处理,聚丙烯酰胺凝胶上就会呈现出不同的DNA谱带,每条DNA谱带就代表了某一序列的DNA片段.为了避免单链DNA、异源双链核酸分子和探针特异性等对分析结果的影响,研究者通常会在PCR-DGGE后进行克隆(Cloning)和测序(Sequencing)来进一步确定DNA序列,进而揭示样品中微生物的菌群结构.这就形成了PCR-DGGE-cloning-sequencing技术.Cole和Luxmy利用该技术证实了生物膜系统内的微生物多样性要远远大于传统活性污泥法.Ebie和Limpiyakorn分别利用该技术对不同污水处理系统内的硝化菌群进行了研究,研究结果表明,尽管监测过程中系统内的AOB含量保持不变,但是由于受到进水水质和温度等外界条件变化的影响,污水生物处理系统内的AOB种群结构发生了巨大的变化.Mota研究间歇曝气对硝化细菌菌群结构以及脱氮效率的影响时发现,好氧时间与缺氧时间的长短会影响硝化菌群结构;与传统理论不同的是,研究者发现脱氮效率与特定的AOB种群含量及AOB的菌群多样性无关.Sundberg在对处理垃圾渗滤液的坡面漫流系统内AOB菌群结构进行了研究,研究发现该系统内的AOB菌群结构并没有季节性的变化,但是在系统不同的处理单元内存在不同种类的AOB菌群.通过PCR-DGGE-cloning-sequencing技术能够揭示污水生物处理系统内的硝化菌群结构及其相对含量的变化.但是聚丙烯酰胺凝胶条带中的硝化菌DNA片段通常在500bp以下,而当从该片断中获得的序列少于已知序列的85%时,就不能准确地在系统发育树上将该硝化菌进行分类,从而无法进一步得到该硝化菌的相关信息.而且由于配制的聚丙烯酰胺凝胶浓度的差异和该方法较低的灵敏度,限制了该技术的重现性以及对含量较少的微生物种群的检测能力.2.3pcr和t-rflp分析PCR-T-RFLP(PCR-terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-末端限制性片段长度多态性)技术是对PCR扩增过程中所使用的引物一端用荧光物质进行标记.当用该引物对样品DNA进行PCR扩增后,PCR的扩增产物就带有了荧光标记.然后选择适当的限制性内切酶对PCR产物进行消化,就可产生不同长度的限制性片段.传统的T-RFLP技术通常只使用一条带有荧光染料的引物和一种限制性内切酶.随着该技术的改进,有的研究者会同时使用两条带有不同荧光染料的引物进行PCR扩增,从而提高目标微生物的分类水平.最后利用DNA自动测序仪和带有其它荧光染料标记的内标物对消化产物的长度进行分析,并获得峰值图.由于每种微生物带荧光标记的限制性片段长度唯一,所以峰值图中每一个峰至少代表一种微生物,每个峰面积与峰总面积的比值代表这种微生物的相对含量.相对于PCR-DGGE技术,PCR-T-RFLP技术能在相对较短的时间内对大量样品的菌群结构进行分析.PCR-T-RFLP技术还具有较好的重现性和更高的灵敏度,从而该技术能够对样品中含量较少的微生物进行研究.自Hiraishi2000年首次报道利用PCR-T-RFLP技术分析活性污泥系统内硝化菌群结构以来,由于该技术在分析微生物群落动态变化上的优势,国内外诸多学者也相继采用了该技术对不同环境下的硝化菌群进行了研究.Egli采用该技术对启动阶段的短程硝化反应器的硝化菌群结构进行了研究,发现反应器内的AOB的种群多样性逐渐降低,而且在不同的温度、pH和SRT条件下AOB的菌群结构是不同的.Park利用该技术探讨了DO对活性污泥中AOB菌群结构的影响;并研究了奥贝尔氧化沟内AOB的菌群结构,发现由于氧化沟内好氧、缺氧环境的交替使得该系统内Nitrosospira-like的含量大大超出其他污水处理厂,而且Nitrosospira-like的存在与SND现象有着较好的相关性.由于PCR-T-RFLP技术要对PCR产物进行纯化和脱盐处理,所以较为耗时,费用较高.该技术方法中采用的荧光染料种类以及内标物的长度的不同可能会引起理论与实际片段长度的差异.这些差异虽然可以通过限定扩增片段的长度来解决,但是与此同时也会使得某些片段得到额外的扩增.此外由于酶切不能人为的控制,某些微生物物种可能也不存在所需要的酶切位点,这些因素都会影响该技术的精确性.2.4目标dna的定量分析获得样品中硝化细菌数量的信息对于进一步深入研究硝化菌群在污水生物处理过程中的作用是至关重要的.目前,国内外普遍采用实时荧光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR)技术对污水生物处理系统内硝化菌群进行定量分析.与传统的末端监测PCR技术不同,实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用仪器对整个PCR反应过程中的荧光信号进行实时采集,随着反应的进行,监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线并获得其阀值(Cyclethreshold,Ct),该Ct值与环境样品中所含的目标DNA成反比.然后将该Ct值与标准曲线进行比较,就可以得出该样品中目标DNA的含量.目前,实时荧光定量PCR普遍采用两种荧光物质来进行定量分析.一种是带有荧光染料的TaqMan探针,一种是SYBRGreen染料.除了正、反向两条引物外,由于一条特异性探针的引入,使得TaqMan探针法相对于SYBRGreen染料法,其对目标DNA的扩增特异性更强.而SYBRGreen染料法的费用较为低廉,而且该方法中所使用的引物较TaqMan探针法更为广泛.无论使用哪种方法首先都要建立目标DNA含量与Ct值之间的标准曲线.目前的研究者大都通过等梯度稀释纯培养目标菌的基因组DNA,或者PCR扩增片段,或者含有目标DNA片段的质粒来建立标准曲线.其中利用质粒建立的标准曲线的重现性最好.根据公式1可计算出已知浓度的DNA溶液中所含目标DNA的拷贝数.PCR扩增的效率可以根据建立的标准曲线的斜率得出,正常的扩增效率应该在80%~85%之间,R2应大于0.95.式中,MW=DNA碱基对数(bp)×660daltons/bp;Daltons-道尔顿,质量单位,1克约为6×1023daltons.与传统的PCR技术和FISH技术相比,由于实时荧光定量PCR具有灵敏度高、重现性好、同时处理的样品量大等特点,研究者已经利用实时定量PCR技术考察了不同的污水处理工艺、运行参数对硝化菌群数量、结构的影响以及硝化细菌的数量和污水处理厂脱氮效果之间的关系[40~41].但实时荧光定量PCR过于依赖DNA的提取效率和探针、引物的特异性,在很大程度上影响了该技术对硝化细菌定量的准确性.Harms和Robinson利用实时荧光定量PCR技术对活性污泥法污水处理厂的AOB和NOB菌群进行定量研究时发现,相对于AOB在污水生物处理系统内的重要作用,其定量结果偏低.有研究者通过添加已知含量的内标物来评估DNA提取和纯化的效率,从而能够更为准确地对污水生物处理系统中硝化菌群进行定量分析.而将实时荧光定量PCR与FISH等其他分子生物学技术联合使用能更好地反映出硝化细菌的数量,避免单一技术所引起分析误差.2.5aod活性成分分析RT-PCR(ReversetranscripatasePCR,逆转录PCR)技术将RNA的反转录技术和cDNA的PCR扩增技术进行结合.首先模板RNA经反转录酶的作用合成cDNA;再以cDNA为模板,扩增合成目的片段.作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物.无论使用何种RNA,关键是确保提取的RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染.Terahara联合应用RT-PCR技术和T-RFLP技术对启动阶段的污水处理厂内AOB的16SrDNA和16SrRNA的研究表明,AOB胞内的16SrRNA要比16SrDNA优先增长,并且外界环境条件的变化将会影响AOB菌群16SrRNA的多样性.尽管amoA是AMO的活性位点,但是采用普通的PCR技术对amoA基因进行分析并不能揭示amoA基因乃至AOB的活性.由于amoAmRNA在AOB体内更新速度快,其半衰期一般仅有几分钟,所以通过RT-PCR技术对AOB体内的amoAmRNA进行分析,能够揭示环境因素对AOB活性的影响,从而及时获得信息来优化污水处理工艺.Aoi通过RT-PCR技术对生物膜反应器中的amoAmRNA的研究表明,氨氮浓度和pH是影响amoAmRNA转录的重要因素,其中当pH较低时,将抑制amoAmRNA的转录.Araki也利用Real-timePCR和RT-PCR技术对活性污泥系统不同反应阶段的amoAmRNA的转录水平进行了分析.3稳定同位素标记实验稳定同位素探测(Stableisotopeprobing,SIP)是指利用稳定同位素标记细胞组分,进而识别出参与某一特定生物代谢过程的微生物种群.该方法实验过程较安全,没有放射性同位素的危险性.由于核酸是采用分子生物学手段分析微生物的主要对象,因此将其作为标记物.核酸分子含有碳、氮、氢和氧元素,可用于核酸标记的