三七总皂苷对高糖诱导糖尿病肾病大鼠gf-

三七总皂苷对高糖诱导糖尿病肾病大鼠gf-

糖尿病性胃炎（dn）是糖尿病常见和严重的长期并发症之一，也是糖尿病的主要原因之一。中医药治疗DN具有独特的优势,创新中药开发及其作用机制研究成为了目前的研究热点。三七具有化瘀止血、活血定痛、补虚强壮的效,其主要活性成分为三七总皂苷(Panaxnotoginsengsaponins,PNS)。课题组前期创新性地研究发现PNS能够改善阿霉素肾病肾纤维化,PNS单体能够降低TGF-β1mRNA表达而延缓DN肾纤维化。根据中医异病同治理论,不同器官纤维化虽然是相对独立的疾病,但发病的某一阶段的基本病理改变是相同的,可以采用相同的治疗方法。在此基础上,本研究进一步将PNS作用于单侧肾切除后一次性腹腔注射STZ大鼠DN模型,探讨PNS对DN的防治作用机制。材料和方法1.材料表面1.1实验动物、饲料纯系SD大鼠44只(购自北京维通利华动物实验中心,合格证号:SCXR京2006-009),雄性,7周龄,体质量220-230g。适应性喂养1周,自由饮水,进食普通饲料;大鼠肾小球足细胞,由美国维恩大学医学部张玉祥教授馈赠。1.2准字点材料PNS:广西梧州制药(集团)股份有限公司,批准文号:国药准字Z20025652;厄贝沙坦(IRB):购自杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司,批准文号:国药准字J20030113;STZ:北京市博爱港商贸有限公司,批号:S-0130。1.3细胞培养和pcr检测光学显微镜(Olympus,L340099);图像分析仪(LEICAQ500IW);全自动生化分析仪(OlympusAU400);RT-PCR电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,JY-SPA);紫外/可见分光光度计(日本UY-2000型);凝胶成像系统(PharmaciaBiotech);细胞培养箱(HeraeustypeB5060EK/CO2,德国);TGF-β1一抗(北京博奥森生物技术有限公司,bs-0103R);Caspase-3一抗(北京博奥森生物技术有限公司,bs-0081R);免疫组化SABC二抗试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司,SP0023);TGF-β1原位杂交试剂盒(天津灏洋,探针序列:5,-GGTGATTCTCTTGTAGTTCTCCAGCCGAC-3,);足细胞培养液:RPMI1640培养基90mL,PBS10mL,104U/mL青霉素/链霉素1.0mL,103U/μLγ-干扰素1.0μL,调pH值至7.2,4℃保存;胎牛血清(杭州四季青);TGF-β1因子(北京康为世纪生物科技有限公司);RT试剂盒(Fermentas公司RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit,K1622);PCR试剂盒(2×TaqMasterMix,北京康为世纪生物科技有限公司);RT-PCR引物序列:GAPDH,FW:CAAGGTCATCCATGACAACTTTG,RV:GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG,496bp;Caspase-3,FW:ATGGACAACAACGAAACCTCCGTG,RV:CCACTCCCAGTCATTCCTTTAGTG,786bp。2.方法2.1糖尿病模型的制备按体质量随机分出正常组10只,剩下大鼠采用单侧肾切除加一次性腹腔注射STZ造模。用10%水合氯醛将大鼠麻醉后(0.4mL/100g)切除右肾,逐层缝合皮肤,术后恢复一周,按照55mg/kg一次性腹腔注射STZ,72h后随机血糖≥16.7mmol/L,尿糖4+以上者为糖尿病造模成功。造模后按体质量随机分组:模型组11只,厄贝沙坦组11只(17.5mg/kg灌胃),PNS组11只(17.5mg/kg腹腔注射)。模型组和正常组每日给予等容积蒸馏水灌胃,共12周。2.2各组含药血清糖、糖、tgf-1、pns的血清见表1大鼠肾小球足细胞复苏,于25cm2细胞培养瓶内加入5mL含5%胎牛血清足细胞培养液,置于33℃、5%CO2细胞培养箱内传代培养。细胞分组:正常组:正常组血清6.7%;高糖组:模型组血清6.7%+葡萄糖4.5%;TGF-β1组:正常组血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmoL;IRB组:IRB含药血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmoL;PNS组:PNS含药血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmoL。于实验前用将处于对数生长期的各组足细胞用无血清足细胞培养液同步24h,然后按细胞分组加入含有含药血清或和葡萄糖足细胞培养液孵育36h,按试剂盒说明提取每组足细胞总RNA,待测Caspase3mRNA。2.3观察指标和测试方法2.3.1观察一般情况观察大鼠的精神状态、体质量、体毛、饮水量、二便及活动情况等,第2、4、6、8、10、12周称量并记录大鼠体质量。2.3.2测定尿蛋白第4、8、12周用代谢笼收集24h尿液,记录尿量,用考马斯亮蓝G-250法测24h尿蛋白定量。2.3.3血清因子水平12周取血,分离血清,检测肾功能和氧化应激相关指标。7150全自动生化测定仪检测血清甘油三脂(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)浓度。2.3.4肾组织病理学检测12周末取大鼠肾组织,称重,记录肾质量/体质量比,取一部分肾组织放入中性福尔马林固定,待做HE、Mallory、Masson、六胺银-HE染色,光镜下观察肾组织病理学变化,并参照文献肾组织病理学检查评分标准对肾小球硬化和肾小管间质损伤评分。2.3.5肾组织tgf-1、caspase-3蛋白表达的免疫组化12周末取大鼠肾组织,一部分放入中性福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,采用SABC免疫组化,一抗稀释比为1∶200,进行肾组织TGF-β1、Caspase-3蛋白显色后封片。2.3.6pc中性福尔马林12周末取大鼠肾组织,一部分放入DEPC中性福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,按照原位杂交试剂盒中说明的方法显示肾组织TGF-β1mRNA,封片。2.3.7pcr反应条件检测Caspase-3mRNA。提取各组足细胞总RNA,用RT试剂盒合成cDNA。PCR试剂盒进行PCR反应,PCR50μL反应体系:TaqMasterMix,2×25μL,ForwardPrimer(10μM)2μL,ReversePrimer(10μM)2μL,Template<1μg,RNase-FreewaterxμL。PCR反应条件:(1)预变性,94℃2min;(2)变性,94℃30s;(3)退火,57℃30s;(4)延伸,72℃30s;(5)(2)-(4)步40个循环;(6)终延伸,72℃5min。最后PCR产物电泳,当溴酚兰移至凝胶中间时切断电源,取出凝胶,置于凝胶成像系统中成像,每组实验重复3次。2.4rt-pcr图像分析免疫组化和原位杂交结果使用Image-ProPlus6.0专业图像分析软件进行图像分析,用ImageJ图像分析软件分析RT-PCR图像。用SPSS16.0进行数据统计,数据用表示,组间比较用方差分析,P<0.05差异有显著统计学意义。糖尿病并发症的预防STZ注射72h后,除正常组大鼠外,其余各组大鼠均有不同程度的进食增加,尿量增多,活动迟缓,消瘦。在第7周时出现多种糖尿病并发症,如腹部包块及溃疡、白内障等,PNS组以上述情况较模型组有不同程度改善。与正常组比较,模型组大鼠体质量在第4周开始,大鼠体质量明显减轻,第8、10、12周有统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,IRB组、PNS组大鼠体质量第8周后显著增加(P<0.05),肾质量/体质量比显著减小(P<0.01)。见表1。3.h尿蛋白定量的单因素试验从第4周开始,模型组大鼠24h尿蛋白定量明显升高,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),随时间推移,模型组大鼠24h尿蛋白定量逐渐增加。与模型组比较,IRB组、PNS组第4周后24h尿蛋白定量显著降低(P<0.05)。见表2。4.no、sod活性模型组与正常相比,血清TG、BUN、Scr、MDA均明显升高(P<0.05),NO、SOD活性明显下降(P<0.01)。与模型组相比,IRB组、PNS能明显降低TG、BUN、Scr、MDA水平(P<0.05),增加NO和SOD水平(P<0.01)。见表3。5.小鼠小鼠肾间质损伤检查评分光镜观察模型组大鼠可见肾小管上皮细胞空泡样变,肾间质炎细胞浸润,系膜细胞增生,系膜基质增多,肾小球内毛细血管扩张,肾小球囊扩张粘连,肾小球基底膜增宽,部分肾小球有坏死。见图1。经过评分,与正常组比较,模型组肾小球硬化指数和肾间质损伤检查评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,IRB组、PNS组肾小球硬化指数和肾间质损伤检查评分显著降低(P<0.01),说明PNS能够减轻DN肾组织病理损害。见表4。6.各组大鼠肾组织tgf-1、caspase-3表达比较图像分析比较各组平均光密度值,正常组大鼠肾组织中有少量TGF-β1、Caspase-3表达。模型组大鼠肾组织中TGF-β1、Caspase-3表达强阳性。与模型组比较,IRB组、PNS组TGF-β1、Caspase-3表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。见表5,图2-图3。7.各组大鼠肾组织中tgf-5mrna表达比较镜下可见原位杂交显色后,TGF-β1mRNA表达在细胞质中。正常组大鼠肾组织中有少量TGF-β1mRNA表达。模型组大鼠肾组织中TGF-β1mRNA表达强阳性。与模型组比较,IRB组、PNS组TGF-β1mRNA表达明显减少(P均<0.01)。见表5,图4。8.足细胞caspase-3mrna表达增加与正常组相比,高糖组和高糖加TGF-β1组足细胞Caspase-3mRNA表达显著增加(P<0.01);IRB组及PNS组足细胞Caspase-3mRNA表达量比高糖组和高糖加TGF-β1组显著减少(P<0.05)。见表6,图5。pns治疗肾纤维化的作用机制异病同治是中医辨证论治体系的重要内容之一,异病同治是指不同的疾病,在其发展过程中,由于出现了相同的病机,而采用同一方法治疗。中医古籍中虽然没有记载DN病名,根据该病的临床表现,可以将其归属于中医“肾消”、“水肿”、“尿浊”、“关格”、“腰痛”等病的范畴。目前认为该病病因病机是多因素综合作用下形成的多脏腑病机变化,其中血瘀是DN的关键病机,活血化瘀法应贯穿该病治疗始终。三七性温、味甘、微苦,归肝、胃经,具有化瘀止血、活血定痛、补虚强壮的效果,兼活血补血之功效于一身,其主要活性成分为PNS。根据异病同治理论,PNS功效切合该病的病机特点,能够应用于治疗DN。已有临床研究报道证实PNS治疗DN有效,但其作用机制尚不明确。本研究创新性地在中医异病同治理论指导下,结合课题组早期的PNS有效抗多种肾病肾纤维化研究成果,从PNS延缓肾纤维化角度探讨其治疗DN的作用靶点和机制,充实异病同治理论内涵。已有研究表明,足细胞凋亡损伤在DN蛋白尿的产生,肾功能的恶化,细胞外基质生成和降解失衡导致肾纤维化方面有重要作用,其中肾脏氧化应激是引起足细胞凋亡的主要因素之一,TGF-β1、Caspase-3是氧化应激引起足细胞凋亡损伤的重要细胞因子。大鼠肾脏组织存在过激氧化应激反应,氧化与抗氧化的失衡加重了DN的进展。DN大鼠肾功能损害时,肾小球和肾小管细胞过度凋亡,可能是促进DN发生发展的重要原因之一。例如,STZ大鼠DN与高血糖引起的肾脏组织细胞中的自由基或氧化应激水平异常有关,其中活性氧簇(ROS)引起包括足细胞在内的肾小球固有细胞凋亡。ROS刺激脂质引起脂质过氧化,导致反映组织细胞的脂质过氧化速率或强度产物MDA增加,SOD和NO能降低氧化应激反应。TGF-β1是公认的促纤维化因子,在DN肾纤维化进展中起重要作用。Nath等报道给予过氧化氢能促进小鼠肾脏和孤立的成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达。TGF-β1高表达能够促进细胞凋亡,细胞凋亡增加时凋亡关键基因Caspase-3基因呈现高转录状态。本实验中模型组大鼠24h尿蛋白定量增加,Scr、BUN明显升高说明大鼠肾功能受损;观察到了,肾组织肾小球和肾小管及其间质出现典型的DN病理改变,肾组织中度纤维化;血清NO、SOD降低,MDA升高,说明DN大鼠处于氧化应激状态。经过PNS治疗后,大鼠肾功能损伤得到一定程度地保护,PNS能够降低血清TG水平,提高NO、SOD水平增强机体抗氧化能力,降低MD