海藻酸钙固定化-半乳糖苷酶的研究

海藻酸钙固定化-半乳糖苷酶的研究

0gos的合成低聚半乳液（gos）是指以（1.3）、（1.4）或（1.6）为基础的半乳液糖组合，其中（1.4）主要。GOS是母乳中的天然成分，能有效促进人体内有益细菌双歧杆菌的生长繁殖，具有整肠、分解致癌物质、促进钙吸收和维生素合成等功能。GOS甜度为蔗糖的20%～40%，口感好，具有优良的酸热稳定性，食用后不易引发龋齿等，可广泛应用于食品加工中。获取GOS的途径主要有3条，即从天然原料中提取、酶法合成和化学合成。但是自然界中GOS含量极少，且无色，不带电荷，难以分离提取。化学合成法需要使用大量的化学试剂，毒性大。酶法合成，尤其微生物酶法合成，原料充分、方便易得、生产成本低，是生产GOS最理想的方法。酶法合成GOS分为游离酶和固定化酶两种。固定化酶法合成GOS具有酶利用率高、稳定性好、GOS产率高、产物后处理工艺少等优点，已成为GOS合成研究的热点。本文对海藻酸钙固定化米曲霉β-半乳糖苷酶的方法、固定化酶的特性以及用于从乳糖直接合成GOS的试验结果给予报道。1材料和方法1.1聚羧酸检测试剂米曲霉β-半乳糖苷酶：自制；考马斯亮蓝G-250：英国进口分装；葡萄糖测定试剂盒：上海荣盛生物技术有限公司；海藻酸钠、乳糖、戊二醛：分析纯。1.2培养箱、仪器和水电池HWY-100B恒温培养摇床、DG-401型电热恒温培养箱、YY0088-92型微量进样器、722型分光光度计、FA2004电子天平。1.3实验方法1.3.1海藻酸钠硬化将一定浓度的海藻酸钠与酶液按一定比例混合，在37℃水浴中使海藻酸钠融化，用注射器逐滴滴入氯化钙溶液中，操作完毕后，移4℃冰箱中硬化2h，过滤洗涤，加入戊二醛溶液交联4h，洗涤，测定酶活力。1.3.2g固定化酶活力测定在10mL1%(w/v)乳糖底物(pH6.0的磷酸缓冲液配制)中加入2g固定化酶，在200r/min、50℃反应10min后，用葡萄糖试剂盒测定酶活力。酶活单位定义为：在55℃、pH6.0条件下，每分钟释放1μmol葡萄糖所需的酶量为1个活力单位。固定化酶的活力回收率按下式计算：1.3.3糖组分的检测取一定量pH为5.5、30%乳糖溶液，置于150mL具塞锥形瓶中，预热后加入一定量固定化酶，在温度50℃、转速200r/min恒温摇床中反应50h，间隔取样，用薄层色谱法检测，计算各糖组分的含量。1.3.4糖组分的测定采用上行的薄层色谱法，以硅胶G作薄板，正丙醇∶水=85∶15为展开剂，点样量为0.2μg/μL，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液为显色剂，110℃加热显色10min，用直接测定法检测各糖组分含量。2结果与讨论2.1海藻酸钠半童糖苷酶条件的选择2.1.1海藻酸钠浓度分别用浓度为2%、3%、4%、5%、6%海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶，测定不同条件下的固定化酶活力，结果如图1所示。固定化酶活力随着海藻酸钠浓度的增大而提高，当海藻酸钠浓度达到4%时，固定化酶活力最高，之后酶活力略有下降。海藻酸钠浓度低时，酶泄漏严重，清洗酶珠时，酶损失较多，酶活力下降；海藻酸钠浓度高时，微环境效应和扩散阻力对反应影响更大，且不易操作，很难将酶液从注射器中挤出。故选用4%海藻酸钠对酶进行固定化较为适宜。2.1.2海藻酸钠4g添加戊二醛浓度对固定化酶活力的影响戊二醛作为一种双功能交联剂，可以使海藻酸钠分子发生交联，同时也能使酶交联在载体上，能够增强海藻酸钠的机械强度和固定化酶的稳定性。分别用浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%戊二醛溶液对制得的固定化酶珠进一步交联，测定不同条件下固定化酶的活力。从图2可以看出，戊二醛浓度为0.3%时，固定化酶相对酶活最高，低于0.3%时，固定化酶活力随戊二醛浓度的增加而增大，但进一步增加戊二醛浓度会导致酶活力下降，这是因为酶分子活性基团被戊二醛过多修饰的结果，故适宜的戊二醛浓度为0.3%。2.1.3液态β-半乳糖苷酶的用量分别称取海藻酸钠4g加入液态β-半乳糖苷酶10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL进行固定化，测定不同条件下固定化酶的活力，结果如图3所示。随着加酶量的增加，表观酶活不断增大，而酶活力回收率不断下降。加酶量为30mL时，表观酶活和酶活力回收率均较高。酶活力回收率下降的原因可能是由于载体内部阻力或载体的表面空间障碍阻碍酶分子的基因被修饰造成的。为了保证单位质量固定化酶有较高的活力，而收率不致太低，考虑既经济可行又能使酶得到充分利用，选择30mL加酶量为宜。2.2液体酶与固定化酶的稳定2.2.1固定化酶的筛选取一定量固定化酶和游离酶于4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度下保存2h，测定酶活力，结果如图4所示。酶经固定化后耐热范围变宽，在60℃保温2h后，固定化酶活力为初始酶活的72%，而游离酶仅为初始酶活的19%。在20～70℃温度下用固定化和游离酶β-半乳糖苷酶水解1mL5%乳糖5min，其结果见图5。固定化酶的最佳反应温度为55℃，与游离酶相同。这一反应温度不仅能提高反应速度，同时又可防止外界微生物的污染，有利于酶在乳品工业中的应用。2.2.2酶稳定性测定取一定量的固定化酶和游离酶于pH为3、4、5、6、7、8、9下保存2h，测定酶活力，结果如图6所示。游离酶的pH稳定范围是4～6，酶经固定化以后pH稳定范围是4～7,pH稳定性提高。在pH<4或pH>7时，固定化酶活力迅速下降，可能是过酸或过碱的环境使酶的活性中心部位基团发生了不可逆的变化。在pH3.0～9.0条件下用固定化和游离酶β-半乳糖苷酶水解1mL5%乳糖5min，其结果见图7。酶固定化以后最佳反应pH和游离酶相比没有改变，均在pH6.0时酶活力最高。2.2.3游离酶将酶在4℃保存，每隔一周取样测其酶活，结果固定化酶在放置8周后仍能保持80%以上的酶活，而游离酶2周后已经降到40%以下。这与海藻酸钙和戊二醛交联使酶结构牢固有关，因此用海藻酸酸钙制备固定化酶，不仅具有较好的热稳定性，而且可以长期保存，为该酶在连续化生产低聚半乳糖中的应用奠定了基础。2.3低聚半乳糖的合成取适量的固定化酶，在温度55℃、pH6.0、乳糖浓度40%时，研究了水相中酶法合成低聚半乳糖的反应历程，结果见图8。随着时间的延长，乳糖的转化率呈上升的趋势，低聚半乳糖合成率呈抛物线变化，葡萄糖和半乳糖的产率呈缓慢上升趋势。在反应时间为30h，乳糖转化率为60%时，GOS的合成率达最大值36.37%,随后GOS开始水解，合成率逐渐降低，说明GOS的合成存在着最适的酶反应时间，反应时间太短或太长都不利GOS的合成。3结论3.1固定化酶法用海藻酸钙包埋、戊二醛进行交联，对β-半乳糖苷酶固定化研究表明，该法简便、酶的活力回收率较高、安全性好。当海藻酸钠浓度为4%，戊二醛浓度为0.3%，加酶量为30mL时，固定化酶珠强度和活力最高。3.2最佳反应温度和ph值与游离酶相比，固定化β-半乳糖苷酶对热、pH值耐受范围较