分子生物学实验分子杂交1

分子杂交实验目的●学习分子杂交的基本原理和操作方法。●了解基因组DNA和探针变性、复性和杂交的动力学过程。●了解杂交过程中各种因素对杂交速率和杂交分子稳定性的影响。实验原理杂交是两条单链核酸在一定的条件下（温度和离子强度）按碱基互补原则退火配对形成双链的过程。杂交是高度特异性的，既可以在体外进行（膜杂交-硝酸纤维素膜），也可以直接在细胞、细菌、组织内进行（原位杂交）。早在1961年有人创建了DNA与RNA间的分子杂交，但至70年代才发展成基因分析中一种重要的分析技术，可鉴定基因的特异性。在杂交前先把待分析的DNA加热或加碱使之变性,分开成单链；然后加入放射性核素标记的核酸探针,降温退火,即获带有放射性核素标记的双链杂交分子。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30～50核苷酸长，可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA。探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记方法有多种，常用的为同位素标记法和生物素标记法。实验原理1975年又发展成转膜杂交，即将电泳分开的核酸片段，经过转移电泳转移到硝酸纤维素膜上，进行固相杂交反应，用放射自显影检出之。此即著名的Southern印迹法。★Southernblot是DNA与DNA（探针）杂交;★Northernblot是RNA与DNA（探针）杂交;★Westernblot是蛋白与其抗体之间的杂交。分子杂交是基因分析中一种重要的分析技术，可鉴定基因的特异性。例如可将具有一定已知顺序的某基因的DNA片段，标上放射性核素，构成核酸探针，将它通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生杂交信号，从而把缺陷的基因显示出来，借此可对许多遗传性疾病进行产前诊断。现又用核酸分子杂交技术诊断乙型肝炎，以及研究其他病毒性疾病和癌瘤的基因结构（癌基因）等Southernblot杂交步骤①被检测样品DNA序列的分离提取（转化质粒、鸡血基因组DNA）。②限制性内切酶酶切及酶切产物的凝胶电泳（EcoRⅠ）。③转膜与固定。④探针制备。⑤杂交与检测。86917-87084140864117056ATG117146-11838213531711091725kb1kb5-6kbneoATGH2BGFPATGBackbone131106-130101123318ATGH2BGFPdab2TargetDNAmutant131106-131259BamHIBamHI132850BamHIBamHIBamHI6k11kb21.9kbwt5’Probe3’Probet120571Southernfordab2,degistwithBamHIWildtype5’probetagettype3’probe5’probe21.9kb11kb6kb3’probe待测样品的酶切（质粒）①调整质粒溶液浓度到1μg/μl。②取高压灭菌的1.5ml离心管加入（冰上操作）：10×Buffer2μlEcoRⅠ1μlddH2O17μlTotal20μl③轻弹管壁并轻轻离心使内容物至管底，37℃反应2～4小时。④瞬间离心使蒸发至管盖上的水分回到管底，供琼脂糖胶分离。

⑤酶切结束后，取3μl酶切产物，琼脂糖电泳检测酶切结果（4条带）。酶切产物的胶分离

Ⅰ：制1.0%的琼脂糖凝胶（胶中不加EB）。

Ⅱ：17μl酶解液中加入3μl溴酚蓝，混匀;取阳性对照DNA（PCR产物）2μl，稀释100倍，取17ul，与3μl溴酚蓝混匀。取标准分子量DNA样品7.0μl。

Ⅲ：上样，120V电泳10分钟，待样品完全跑出上样孔后，2V/cm电泳16小时。

转膜前凝胶处理

▼电泳结束后，切去多余的胶，测量胶的宽度和长度，切去一角作为点样标记。▼脱嘌呤：室温15min(溴芬兰变黄）▼变性(Denaturation):浸入碱性缓冲液(1.0MNaCl,0.4MNaOH)轻微振荡15min，换一次继续浸泡凝胶20min（用于N＋尼龙膜）（溴芬兰变兰）。▼中和(Netralisation):15min（NaCl,Tris-base)转膜（1）◆当凝胶仍在变性时，取一塘瓷方盘上架上一块长和宽均大于凝胶的玻璃板,板上铺上清洁的Whatman3MM滤纸，盘中加入足够量的转移缓冲液(10xSSC)，滤纸两端浸在溶液中，当3MM滤纸湿透后，用玻璃棒赶出所有气泡。

◆用一干净的剪纸刀裁一张长和宽比凝胶大1mm的尼龙膜（N＋），并用刀切去一角，以便与凝胶的切角相对应，处理膜时应带手套并用平头镊子操作；然后将膜漂浮于一盘去离子水的液面上完全湿润，再将其碱性转移缓冲液中至少5min。

Whatman3MM滤纸Whatman3MM滤纸胶（正面朝下）膜转膜（2）▼从变性液中取出凝胶，倒置凝胶（点样孔向下，背朝上）于湿润的3MM滤纸中央，用玻璃棒滚动去除滤纸和胶之间的气泡；▼用P