植物的快速繁殖和脱病毒技术

第5章植物的快速生殖和脱病毒技术利用离体培育技术，将植物外植体在人工培育基和适宜的条件下进展培育，以在短期内获得大量遗传性全都的个体的方法称为离体快速无性生殖，简称为离体生殖〔invitropropagation〕、微生殖〔micropropagation〕或快速〔养分〕生殖〔rapidpropagation〕。由离体无性生殖获得的植株称为试管苗。无性系(无性生殖系，克隆〕：由同一外植体或细胞增殖的培育物。一般适用范围：加速难生殖或生殖缓慢植物的生殖.易染病毒植物的脱毒生殖.不能用种子生殖的杂合体园艺作物.产生的品种.第1离体快繁的一般技术途径和方法:快速生殖过程一般分成以下几个阶段:预备阶段〔0阶段〕增殖阶段：芽的增殖,促长；生根阶段：诱导芽生根；无菌培育物的建立(初代培育;primaryculture)一般过程包括:外植体的选择和消毒培育基和植物生长物质的选择环境条件的选择和培育初代培育留意事项保证无菌条件适宜技术过关防止褐变褐变缘由：外植体中的酚类化合物在多酚氧化酶的作用下氧化。影响褐变的因素植物种类和基因型外植体的取材部位和生理状态培育基成分防止褐变的常用方法〔目前尚无通用的防止褐变的有效方法.〕选择适当的外植体选择适宜的培育基和培育条件使用抗氧化剂准时转接等增殖阶段(芽的增殖;shootmultiplication)使外植体在数量上快速增加。罗士韦〔1978〕:植物离体分化过程的类型分5种：:节培法;微型扦插法丛生芽增殖型器官发生型胚状体发生型原球茎型李文安〔1998〕:分10类器官型器官发生型胚状体发生型原球茎型球茎芽型块茎型鳞茎型孢子型根茎型微枝扦插型促进侧芽的形成和生长〔丛生芽增殖型；促进腋生分枝〕根本过程：初代培育的芽在适宜的培育基上培育，使侧芽不断分化和生长，渐渐形外植体：顶芽或侧芽。植物生长物质：细胞分裂素:常用6-BA、KT、2ip和Zt等;一般加0.1~10mg/L，常用0.5~2mg/L；生长素常用NAA、IBA和IAA，浓度为0.1~1.0mg/L。;1000~2000lx照明，每日16h或24h〔或全黑暗〕。特点：能较好保持遗传稳定性；但过程较简单。诱导不定芽形成不定芽：.在很多器官和愈伤组织上都能诱导出不定芽。但可使嵌合性状遭到破坏〔图5-1〕。和Zt,浓度0.1~10mg/L;常用生长素：NAA，IAA和IBA。二者比例:一般细胞分裂素高于生长素，但也有承受接近1的配比。图5-1杂色天竺葵的茎尖〔上〕和叶柄〔下〕培育诱导胚状体的形成(体细胞胚胎发生Somaticembryogenesis〕外植体选择： 使用合子胚、分生组织或子房、花药等生殖器官.植物其它局部也有直接或间接产生胚状体的力量.培育条件：丰富铵态氮的培育基上,加2,4-D诱导胚状体的发生,然后转移到降低2,4-D浓度或没有生长素的培育基上使胚状体成熟和萌发.优点：增殖率高,且具双极性. 应用：人工种子等缺点：很多主要的作物还不能形成胚状体,或产生的胚状体难以形成植株,或成苗率太低,以及遗传性不够稳定。生根〔根的诱导;根的再生;Rooting〕方法：将增殖的芽剥离下来，分别种植到的培育基上，诱导生根。,其它的需要在培育基中参加适量的生长素,一般浓度为1~10.0mg/L,常用NAA、IBA和IAA。根本培育基：一般用盐浓度较低的培育基。蔗糖浓度可降低到1.0~1.5%左右。试管苗的移栽〔Transplantation〕炼苗〔驯化〕：试管苗逐步熬炼和适应外界环境条件的过程.,表皮毛无或极少而薄,气孔不能关闭等.过程：渐渐降低湿度,渐渐增加光照；加生长延缓剂等。快速生殖生产中应留意的问题遗传稳定性影响遗传稳定性的因素主要有：外植体来源继代培育再生植株发生方式D植物生长物质提高遗传稳定性,削减变异发生的措施主要有:a选择适宜外植体b削减继代次数,缩短继代时间;c使用生长点或侧生分枝方式扩繁;d选用适当的植物生长物质种类和较低浓度等e定期检查,剔除形态和生理特别苗;f尽量促进再生植株开花结实,以检查其生物学性状和经济性状是否稳定.玻璃化组培中特有的一种生理病变。影响玻璃苗发生的因素：培育材料环境因素培育基成分可能的预防性措施：降低容器内的空气相对湿度。留意通气，改善容器内的氧气供给。避开培育温度过高，一般昼夜变温交替效果较好。酌情调整光照时间和强度等。NH4+浓度，依据具体状况调整其他元素的含量。适当降低培育基中细胞分裂素的浓度。留意碳源种类和浓度的选择。PP或 等。PP333快繁实例唐菖蒲(Gladiolusgandavensis)月季7~10d消毒茎尖→→MS0① ② ↓↓③MS+6-苄基嘌呤(BA)1.0mg/L+萘乙酸(NAA)0.01mg/L或MS+6-BA1.0mg/L+感动素1.0mg/L+NAA0.5mg/L的固体培育基25d形成芽丛(每个茎尖可产生10~40个芽)⑤↓芽丛切割,重复③~⑤月季快繁

⑥↓延长培育,苗的基部渐渐膨大，芽梢伸长转绿2.0cm时MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L固体培育基上诱导生根7~8天见到根的突起,20多天可产生大量的根⑨↓进展移栽.强健优良母株的嫩茎去叶↓消毒(70%酒精0.5~2sec,0.1%HgCl2

5~8min),↓嫩茎切段(0.5~1.0cm)固体培育基〔MS+6-BA0.5~3.0mg/L+NAA0.01~0.2mg/L〕↓日温20~250C,夜温15~200C,每日光照10h,光照强度1000lx.↓20d左右 ↑形成丛生芽→芽丛切割→→↑↓壮苗培育〔MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L固体培育基〕↓枝条长到3cm左右时，切下枝条诱导生根〔MS+1mg/LIBA或0.5~1.0mg/LNAA〕↓7~10d基部愈合并形成根原基↓将苗取出，直接插入稻壳灰与土(1:1)的养分钵中,用塑料薄膜掩盖↓5~6天小苗生根,梢生长 1Mon. 定植或上盆.第2节无病毒植物的培育附表：危害局部园艺植物的病毒数目防治植物病毒病的方法物理方法1〕热处理脱病毒〔又称温热疗法，thermotherapy〕：温汤浸渍处理(温水浸泡)：适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料；热风处理〔干热处理〕：休眠组织和正在生长的组织都适用，特别是茎尖培育结合热处理可获得较抱负的脱病毒效果。热处理的时间和温度因植物种类及器官生理条件不同而异.原则：既能使体内病毒钝化,又能保证肯定程度的寄主存活率.2) 低温处理脱病毒〔冷冻法：cryotherapy〕化学方法利用能钝化、抑制和消退植物病毒的一些化合物化合物植物病毒*寄主三氮唑核苷CMV,PVY,TMV烟草(ribavirin)ACLSV苹果LSV,TBV百合ORSV大花惠兰PVY,PVX,PVS,PVM马铃薯EMCV茄子阿糖腺苷(vidarabine)OMV虎眼万年青碱性孔雀绿(malachitegreen)PVX马铃薯2-硫尿嘧啶(2-thiouracil)PVY烟草放线菌素-D(actinomycin-D)TMV大白菜*：CMV：黄瓜花叶病毒；PVY：马铃薯病毒Y；TMV：烟草花叶病毒；ACLSV：苹果褪绿叶斑病毒；LSV：毒S；PVM：马铃薯病毒M；EMCV：茄子杂色皱病毒；OMV：虎眼万年青花叶病毒。生物方法种子生殖 适用于不侵染种子的病毒.但无性生殖作物不适宜.茎尖培育(shoot-tipculture)茎尖培育脱毒的原理越靠近生长点，病毒浓度越低。可能缘由：传导抑制；酶缺乏；能量竞争；抑制因子茎尖培育脱毒一般过程.剥离和接种培育条件影响茎尖培育脱毒成功的因素脱毒培育是否成功取决于两点:离体茎尖能否成活;成活的茎尖还有没有病毒.茎尖大小,越易成活,但病毒越难去除.一般带一两个叶原基的茎尖比较适宜.培育基植物生长物质的种类和浓度茎尖培育的根本过程选择母株──可能时预先进展病毒测定──必要时进展预先热处理(30~36oC,6~12周)剥离适宜大小的茎尖↓培育─必要时可热处理(30~40oC)↓─必要时在培育基中参加抗病毒化合物再生植株↓切段或其它生殖形成的无性系↙ ↓ ↘局部保存 局部移入室内备病毒鉴定用 局部试管苗直接用于病毒鉴定↓ ↓↓ (1)指示植物(2)免疫学(3)电镜(4)分子生物学方法保存→移栽→无性系选择(有无生理或遗传上的变异)↓ ↘品种比照试验(产量,对环境适应性及抗病性等)选择适宜的无性系进展大量生殖↓无病毒原原种↓扩大繁育生产体系↓〔microgrfting，离体微型嫁接〕是将茎尖培育与嫁接方法相结合，用以获得无病毒苗木的技术。培育，愈合后成为完整植株。因接穗易成活，可培育很小的茎尖〔<0.2mm〕目前主要应用在果树脱毒方面。珠心组织培育柑橘类多胚品种有多个珠心胚。问题：变异率较高〔约20%~30%〕，幼年期较长等。愈伤组织培育脱毒法可能得到无病毒苗。可能的机理：①病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织中分布不均匀。的复制力量衰退或丧失。问题：易产生变异。茎圆盘半球培育法〔stem-discdomeculture,简称SD-Domeculture〕植株感病的大蒜蒜瓣↓外表消毒切成薄片↓接种在含激素的培育基上↓5d圆盘外表长出半球体↓在培育的5~7d后从外植体剥离半球体,转移到无激素的LS培育基上↓2周高约1cm的苗↓8周带根的高8cm的试管苗↓移栽(不呈现病毒病症)↓进展RT-PCR分析(,结果说明这些植株均不含供体植株携带的大蒜病毒)再生植株病毒鉴定病症直接检测: 植株茎叶中是否有该病毒所特有的可见病症.指示植物测定:指示植物：对某种或某些特定病毒格外敏感的植物.将受检植物的液汁轻轻涂于指示植物叶片上,加细石英砂适当用力磨擦,使指示植物叶外表受到侵染,但又不要损伤叶片…….:先给动物注射病毒获得抗血清,再将分别的待测植株液汁参加,观看有无沉淀消灭。〔ELISA〕：用酶标记抗原或抗体的微量测定法。电镜法:直接观看有无病毒微粒的存在，以及微粒的大小、形态和构造，借以鉴定病毒的种类。分子生物学方法：核酸杂交；PCR；dsRNA等。操作实例：葡萄脱毒及无毒苗试管生殖技术〔曹孜义等，1991〕将盆栽葡萄在38oC热处理箱中处理2~3个月，然后把长出的枝蔓消毒，再取下顶尖和侧芽，剥取2~3mm长的茎尖，接种到茎尖培育基上〔1/2MS根本培育基，每升