大鼠双侧肾上腺切除术后下丘脑室旁核mr、gr表达的变化

大鼠双侧肾上腺切除术后下丘脑室旁核mr、gr表达的变化

干预神经因素的遗传因素（hyp-a）是调节身体和环境平衡、维持和调节身体衰老过程的重要因素。糖皮质激素与皮质类固醇激素受体——盐皮质激素受体(mineralocorticoidreceptor,MR)和糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR)结合,反馈作用于垂体和下丘脑构成HPA轴负反馈调节的主要通路。其中下丘脑室旁核(periventricularnucleus,PVN)有直接激活HPA轴的作用,是HPA轴的调节中心。本实验建立大鼠肾上腺切除模型,应用免疫组织化学方法观察了肾上腺切除后大鼠下丘脑室旁核MR、GR的表达变化,为进一步研究MR、GR在调节HPA轴中发挥的作用提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物及分组成年健康雄性Wistar大鼠70只,体重200～220g,中国医科大学实验动物中心提供,实验室条件饲养,随机分正常组、肾上腺切除0,4,7d组及假手术组。每组10只。1.2小鼠肝肾损伤前引物前充液将大鼠用戊巴比妥麻醉后,取俯卧位固定于蛙板上。从最后胸椎处向后沿背部正中线做约2cm长的皮肤切口。在肾脏前内侧脊柱下方找到淡黄色的肾上腺并摘除,同法摘除右侧肾上腺(位置稍靠前),缝合肌肉和皮肤,并涂以碘酊。对照组进行与实验组相似的手术,但不摘除肾上腺。术后保持室温为21～25℃,以葡萄糖液、生理盐水代替饮水。1.3抗组织化学染色各组大鼠称体重后,腹腔内注射戊巴比妥麻醉,打开胸腔,从左心室插管至升主动脉,剪开右心耳,生理盐水快速冲洗后,4%的多聚甲醛灌流固定,取脑组织在同种固定液中续固定3h,40%的蔗糖沉糖,制作冰冻切片,进行免疫组织化学染色。1.4抗mr、gr抗体恒冷箱切片机(型号Leica)制作冰冻切片,厚14μm,0.01MPBS漂洗后切片依次经0.03%Tritonx-100浸泡10min、3%H2O2-甲醇20min以阻断内源性过氧化物酶、5%BSA封闭20min后滴加兔抗MR、GR抗体(MR工作浓度为1∶200、GR工作浓度为1∶500MR、GR均购于SantaCruzBiotechnology公司),4℃冰箱孵育过夜,(对照组加0.01MPBS代替一抗)再滴加生物素化羊抗兔IgG和即用型SABC(免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司),以上各步间用0.01MPBS漂洗,DAB显色,脱水,透明,封片,光学显微镜(OLYMPUS,BX60,Japan)下观察并摄片。1.5平均光密度测定采用MoticImagesAdvanced3.2图像分析系统,在下丘脑室旁核区测每高倍(10×40倍)视野内MR、GR的光密度值,每张切片选2～3个视野,计算各组平均光密度(IOD)。所得数据用SPSS13.0软件处理,采用方差分析进行两两比较,以P<0.05为有统计学意义。2结果2.1室旁核神经元/细胞内表达的产物正常组、假手术组及肾上腺切除组MR免疫反应阳性产物呈棕黄色表达,位于室旁核神经元的细胞质和细胞核内。各组免疫反应阳性神经元的数目及染色强度无明显变化(P>0.05)(表1、图1)。2.2gr免疫反应阳性细胞数目、染色强度的比较GR免疫反应阳性产物呈棕黄色表达,正常组、假手术组的GR主要分布在室旁核神经元的细胞质与细胞核中。肾上腺切除组:0d组GR免疫反应阳性细胞数目、染色强度与正常组、假手术组相比,无显著性差异(P>0.05)。4,7d组GR免疫反应阳性细胞数较正常组、假手术组明显增多,染色深(P<0.05),免疫反应阳性产物主要分布在细胞质中,7d组较4d组免疫反应阳性细胞多,染色更深,表达增强(P<0.05)(表2、图2)。腺切除4d组比较**P<0.05。。3糖皮质与糖激素的作用下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)由下丘脑、垂体、肾上腺组成,三者构成一种级别上的相互协调的反馈调节系统。下丘脑的室旁核(PVN)是HPA轴活动的直接控制部位。当下丘脑接受来自高位中枢信息时,PVN的小细胞神经元分泌多种促进促肾上腺皮质激素分泌的激素,其中最重要的是促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和精氨酸加压素(AVP)。CRH和AVP经垂体门脉血流到达垂体,并刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素(ACTH);后者经血液循环到达肾上腺,刺激肾上腺皮质合成和分泌糖皮质激素(灵长类动物以皮质醇为主,啮齿类动物以皮质酮为主)。糖皮质激素与皮质类固醇激素受体-盐皮质激素受体(MR)和糖皮质激素受体(GR)结合,反馈作用于垂体和下丘脑构成HPA轴负反馈调节的主要通路。MR、GR这两个受体属于核受体家族,他们是能与特异性激素结合的蛋白,主要是一类配基依赖性转录调节因子,通过调节基因表达诱导或者抑制细胞的增殖、分化和死亡,导致多种生物效应。核受体的最大特点是未与激素结合前位于细胞质中,当受体和激素结合后导致受体的活化,活化的受体发生核转位,使受体由细胞质进入细胞核发挥转录调节作用。MR在中枢的表达比较集中,主要局限在海马、外侧隔核、杏仁核、嗅核、穹窿下器官、下丘脑等区域。GR广泛分布于大脑各区,以边缘系统的海马、隔区、下丘脑最为丰富。本实验通过免疫组化技术检测了正常组、假手术组及肾上腺切除0,4,7d组下丘脑室旁核MR、GR的表达变化。实验结果表明,肾上腺切除后下丘脑室旁核MR的表达无显著变化,而GR表达上调。并且GR的免疫反应阳性产物主要分布在细胞质中。这种结果说明位于下丘脑室旁核的MR可能没有直接涉及HPA轴的调节。曾有报道,海马的MR与糖皮质激素结合,参与HPA轴的负反馈调节,杏仁核、前额皮质的MR与糖皮质激素结合可以激活HPA轴。我们推测MR在各个脑区的作用是不同的,下丘脑室旁核MR与皮质酮结合的作用可能是对水盐摄取和血压的调节。肾上腺切除后GR的表达升高,部分神经元免疫反应阳性物质主要分布在胞质,表明肾上腺切除后糖皮质激素水平下降或缺