plga-丝素-胶原纳米三维多孔支架的制备及细胞相容性研究

plga-丝素-胶原纳米三维多孔支架的制备及细胞相容性研究

周围神经损伤的恢复和重建是临床难题，也是组织工程的有效解决。SC在神经再生和功能恢复中具有重要作用，组织工程神经的制备需要大量SC及良好的支架载体。纳米纤维支架具有拟生性好、比表面积大、高渗透性、可控释活性物质等优点，胶原是ECM的主要结构成分，具有良好拟生性能；PLGA可降解，具有良好的机械性能；蚕丝有较高的强度和柔性，对水和氧通透性好。将采用静电纺丝法制作的PLGA、丝素、胶原纳米支架与细胞复合后，细胞能在支架上生长。但利用纳米技术制作PLGA-丝素-胶原三维多孔支架并将其应用于神经组织工程，目前报道较少。我们的实验采用静电纺丝法制备PLGA-丝素-胶原和单纯PLGA纳米三维多孔支架，观察其理化性质，并将其与SC复合培养，评价其细胞相容性，为纳米组织工程神经的进一步研究和临床应用提供理论依据。1材料和方法1.1材料、试剂与仪器3d龄SD近交系乳鼠8只，雌雄各半，体重15～24g，由四川大学华西医学实验动物中心提供。PLGA(1∶1，与四川大学生命科学中心联合研制）；蚕丝（双宫丝，成都天友丝绸公司）；水溶性胶原蛋白（相对分子质量6000×103,AR级，四川铭让生物科技有限公司）；六氟异丙醇（Sigma公司，美国）；遗传霉素（GIBCO公司，美国）；抗S-100蛋白多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）。BGG40/2高压直流电源（天津大学新技术开发中心）；Reger3050材料试验机（深圳瑞格公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；扫描电镜（JEOL公司，日本）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）。1.2静电纺丝plaga的制备电纺丝溶液的制备：将蚕丝于0.1%Na2CO3水溶液中煮沸30min，重复3次，去除丝胶。将丝素用CaCl2、H2O、C2H5OH三元溶液（摩尔比1∶8∶2）在78～80℃下溶解，溶液经透析过滤后置于ABS盘内室温干燥成再生丝素膜。将再生丝素膜、水溶性胶原蛋白粉末及PLGA按质量比1∶1∶2共同溶于六氟异丙醇中，PLGA终浓度2%，作为实验组；将单纯2%PLGA溶于六氟异丙醇中作为对照组。将两组电纺丝溶液加入安装了已磨钝的12号不锈钢针头的10mL注射器，针头与BGG40/2高压直流电源的正极相连，针头下方安装1个接地铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏与高压直流电源负极相连。在外加电压10kV，接收距离10cm，电纺丝溶液流量为4mL/h的条件下进行静电纺丝。收集接收屏表面获得的无纺纤维毡，置于干燥器中干燥后裁剪成10mm×10mm大小的样品作为支架备用。1.3物理性能评价1.3.1描电镜观察将两组支架样品表面喷铂金处理后，扫描电镜观察。实验组和对照组各取5个样品，每个样品选取5个视野，每个视野测量10个纤维直径值，取均值进行分析。1.3.2孔隙率的测定采用压汞法测定支架孔隙率。两组各取5个样品测定体积后抽真空，将汞充至多孔支架周围，再从外部对汞加压，记录压力和加压过程中进入孔中汞的体积，孔隙率=进入孔中汞体积/支架材料体积×100%。1.3.3滤纸吸干性能两组各取5个样品置于双蒸水中24h，滤纸吸干表面的水分称重（Ww），冻干后称重（Wd），吸水率=[（Ww-Wd）/Wd]×100%。1.3.4抗张力测试两组各取5个样品置于Reger3050材料试验机上进行拉伸试验，测定抗拉强度，拉伸速率为100mm/min。1.4体外生长曲线无菌条件下取SD近交系乳鼠双侧臂丛神经和坐骨神经，置入Hank液中，解剖显微镜下剔除外膜，剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶混合液消化30min。将细胞悬液按1×105个/mL细胞密度接种于预涂有多聚赖氨酸的培养瓶，于37℃、5%CO2孵箱中培养30min，收集未贴壁细胞重新接种于培养瓶中，含20%FBS的DMEM培养基培养24h，更换为含有G418(100g/mL）的DMEM培养基，48h后更换为DMEM培养基，培养24h后再换无血清培养基，培养72h后更换为含20%FBS的DMEM培养基，以去除成纤维细胞。8～10d细胞长满瓶底后采用0.025%胰蛋白酶-EDTA传代。倒置相差显微镜下观察生长情况。取第4代SC按5×104个/mL细胞密度接种至盖玻片上，待长满盖玻片70%后，采用S-100免疫组织化学染色观察，在100倍显微镜下，每张玻片随机选择10个视野，计数每个视野的阳性细胞和阴性细胞数，计算阳性细胞百分比，表示SC纯度。1.5细胞毒性试验1.5.1纳米三维多孔提取物提取物将无血清DMEM培养液与两组支架采用国家标准制备浸提液，并用DMEM和FBS配成含20%FBS的25%、50%及100%浓度浸提液。1.5.2两种浸提液的dmem培养取第4代SC调整密度为5×104个/mL接种于96孔板上，每孔200µL。待细胞贴壁后分别与25%、50%及100%浓度的两种浸提液培养，作为实验组；以DMEM培养作为空白对照组。培养1、3、5、7d每孔加入20μLMTT溶液，37℃下培养4h后加入150μLDMSO，酶联免疫检测仪在490nm测定吸光度（A）值。1.6干预细胞和支架的复合培养1.6.1dmem培养基的制备将PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔实验组支架置于75%乙醇浸泡30min，紫外光照射2h,PBS浸泡24h后更换DMEM培养基浸泡24h，置于12孔板。将第4代SC以5×104个/mL密度接种至支架，以含20%FBS的DMEM培养基培养，作为实验组。将单纯PLGA支架同上法与第4代SC复合培养作为对照组。1.6.2扫描电镜观察(1)扫描电镜观察：复合培养2、4、6d后取出两组支架，每次各取1片。4℃以2.5%戊二醛固定24h,PBS冲洗，1%锇酸4℃固定4h，梯度乙醇脱水，CO2干燥器干燥、喷金、黏托，扫描电镜观察。(2)激光扫描共聚焦显微镜观察：复合培养4d后，两组支架以S-100蛋白免疫荧光标记SC，激光扫描共聚焦显微镜观察，X轴扫描和三维重建，观察SC在材料上的三维生长情况。1.7统计方法采用SPSS11.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P值<0.05为有统计学意义。2结果2.1纤维直径、吸水率及观念差异扫描电镜显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构，孔与孔之间高度贯通，纤维交错相叠，较为光滑均一（图1）。实验组和对照组纤维直径分别为（141±9)nm和（205±11)nm；支架内孔洞相互连通，孔隙率分别为87.4%±1.1%、85.3%±1.3%；吸水率分别为2647%±172%、2593%±161%；抗拉强度分别为（0.32±0.03）、（0.28±0.04)MPa；两组以上指标比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。2.2s-100免疫海兰加尼细胞的增殖培养24h后，多数细胞贴壁，呈双极梭形，并在双极伸出细长突起（图2）。成纤维细胞胞体较大，扁平，呈不规则形，无细长突起，覆盖于瓶底。第1次传代前可见较多成纤维细胞。经G418及无血清培养基培养后成纤维细胞数量逐渐减少。0.025%胰蛋白酶-EDTA传代时可见SC突起收缩，轻微振荡即可脱落，而成纤维细胞收缩较晚，仍贴附于瓶壁，约7d可再次传代。至第5代可见大量SC，少见成纤维细胞。S-100免疫组织化学染色显示大量梭形、棕色浓染的SC，按“肩对肩”或“端对端”排列，呈阳性（图3）。SC纯度为96.5%±1.3%。2.3时间延长SC在不同浓度实验组及空白对照组中生长均良好，A值均随时间延长而增大。同组各时间点A值比较，差异均有统计学意义（P<0.05），各时间点各浓度实验组及空白对照组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见图4。2.4关于细胞和支架的复合培养2.4.1sc生长增殖细胞复合培养2d，实验组SC在支架上生长良好，细胞多呈梭形，双极突起，少数呈三角形或不规则形，有3个或多个细长突起。对照组SC在支架上贴附生长，但数量较少。复合培养4d，实验组SC生长增殖，轴突相互连接，并有基质分泌；对照组SC开始增殖，数量明显较实验组少。复合培养6d，实验组SC大量增殖，细胞覆盖支架表面，孔洞内可见细胞生长，并有基质分泌；对照组SC轴突连接，生长增殖（图5）。2.4.2激光扫描共聚焦显微镜观察复合培养4d，实验组SC在支架表面密集生长，大量增殖，细胞之间以轴突相互连接；对照组SC在支架上生长，细胞充分伸展，细胞数量较少（图6）。3神经流变学及生物活性材料自体神经移植是周围神经损伤后神经移植的“金标准”，但自体神经移植来源有限，会残留供区感觉功能障碍和增加供区创伤。采用静电纺丝法构建的纳米组织工程神经支架修复周围神经缺损，具有如下优点：(1)拟生态性：静电纺丝法可以制备500～600nm的纤维，这和自然存在的神经纤维在同一数量级上。可以为神经细胞在体外的生长、发育和细胞间信息传导提供理想的微环境。(2)高比表面积：与其他微型材料相比，具有更高的比表面积，纳米纤维能够携带更多的神经细胞或药物，产生更好的效果。(3)可控释活性物质：将携载药物或细胞因子的纳米纤维制作成支架，通过调控支架的密度和厚度，达到控释目的。(4)高渗透性：有利于营养物质的渗透、氧气摄入和废物排出。Kitazono等研究发现，NIH3T3细胞在静电纺丝法制作的PLA纳米纤维上生长良好，可用其修复大鼠坐骨神经缺损，支持神经轴突生长。Yang等发现神经干细胞在纳米纤维上的分化较微米级支架要好。研究表明，PLGA浓度越低，获得的纳米纤维直径越小，更光滑均一。我们实验采用静电纺丝法制备了PLGA-蚕丝-胶原及单纯PLGA两种纳米三维多孔支架。均光滑均一，支架内孔洞相互连接。本实验PLGA浓度为2%，制备的PLGA-蚕丝-胶原纳米三维多孔支架纳米纤维直径为（150±200)nm，孔隙率达80%以上。与单纯PLGA纳米多孔支架相比，其纤维相对较细，孔隙率大，抗拉伸能力更强。纳米三维支架应用于神经组织工程，其材料来源可为天然材料、合成材料和复合材料。ECM是促进神经损伤后神经细胞生长的理想物质，胶原蛋白作为ECM的主要成分，生物相容性好，但胶原机械性能欠佳，缺乏必要的力学强度。PLGA可降解，具有良好的生物安全性和机械强度，但PLGA在生物相容性及生物活性方面不及胶原蛋白。Bini等研究发现，C17.2神经干细胞能在纳米PLGA纤维上生长分化。胶原与PLGA复合构成的合成材料具有两者优点，效果更好。贾骏等研究表明PLGA纳米纤维支架经胶原改性后，细胞相容性有效提高。Schnell等研究表明，SC在聚己内酯-胶原纳米纤维支架上较聚己内酯纳米纤维生长更好。神经支架载体需要有一定的柔性和合适力学强度，并能引导神经再生。蚕丝具有良好的柔性，在材料本身的性能上与神经相接近。张文怡等采用蚕丝支架能维持SC细胞的正常形态和功能。Sahoo等发现PLGA-丝素纳米纤维支架可作为肌腱、韧带组织工程的合适载体。我们将SC种植在PLGA-丝素-胶原和单纯PLGA纳米三维多孔支架上的结果表明，单纯PLGA纳米三维多孔支架上黏附细胞较少，细胞形态好，具有生长增殖能力；PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架上细胞贴附良好，生长旺盛，细胞形态均一，细胞轴突相互连接，并且向孔洞内呈立体三维生长，伴大量基质分泌，是SC生长增殖的良好载体。纳米支