pe表面改性及其抗凝血性能研究

pe表面改性及其抗凝血性能研究

由于苯二甲酸乙二醇酯（pe）的良好耐用性，已被用作人工血管。缝合人工心脏瓣膜，缝合心脏瓣膜上的碎片，缝合人工韧带和医疗接头。但由于聚酯的分子结构对称,结晶度较高,结构中又没有高极性基团,因此亲水性较差,植入体内时血液相容性也较差。由于聚酯是高结晶性聚合物,非晶区相对较少,分子主链又缺少可供接枝的活性基团,因而接枝改性较困难,作者主要采取紫外辐照手段,使表面的C—H产生均裂形成自由基,再接枝亲水性高聚物聚乙二醇(PEG),最后通过化学偶合法接枝抗凝血药物肝素(Hep)。1实验部分1.1实验试剂和仪器紫外照射装置,自制;754型分光光度计,上海科析仪器成套公司;X-650型扫描电子显微镜;AAc(AR),天津化学试剂厂;肝素(效价≥150u/mg),上海佰奥生物科技有限公司;甲苯胺兰(AR),百灵威公司美国SIGMA进口分装;柠檬酸钠(AR),重庆天府精细化学品厂;乙酸异戊酯(AR),广东西陇化工厂。1.2干预厚膜将PET膜裁剪成2cm×2cm的正方形试样,经丙酮、三氯甲烷、甲醇分别振荡清洗后,真空干燥24h备用。1.3共辐射法peg将PET膜浸入PEG中,在紫外照射装置中辐照接枝一定时间。取出后用蒸馏水清洗8h。干燥备用。1.4共价偶合费诗集peg1.4.1辐照接枝n气保护将丙烯酸(AAc)用适量活性炭吸附阻聚剂对苯二酚,过滤后充入N2以除去溶液中的O2。配置0.3%的高碘酸钠的丙酮溶液,滴加在PET膜上,溶剂挥发后。将膜片浸入10%(w/w)的丙烯酸水溶液中,在紫外照射装置中进行辐照接枝(N2气保护)。接枝完后的PET-AAc膜片在70℃蒸馏水中,搅拌下充分洗涤以除去均聚产物。自然晾干备用。1.4.2羧基化反应edc的合成将PET-AAc膜片放入pH=4.7的蒸馏水中,加入对应比例的EDC,4℃冰浴下活化羧基2h。倒入PEG(或氨基端PEG)水溶液,冰浴下搅拌反应2h。撤去冰浴,室温下继续反应22h。取出膜片,蒸馏水清洗24h。干燥备用。1.5-冰浴下搅拌将肝素配成水溶液(pH=4.7),加入对应比例的EDC4℃冰浴下搅拌反应2h。将接枝了PEG(或氨基端PEG)的PET膜放入上述混合液中,4℃下反应2h,撤去冰浴,室温下继续反应22h。取出膜片,蒸馏水清洗24h,干燥备用。1.6标准曲线的绘制向加塞锥形瓶中加入4mg若丹明6G,加入4ml磷酸缓冲液(PBS,pH=12)溶解。立即加入100ml苯,剧烈震荡进行萃取。将上层黄色萃取液作为染色剂。将染色剂适当稀释,使其在486nm的吸光度为0.4。配制不同浓度的丙烯酸溶液,分别加入一定量的染色剂,搅拌均匀,移入比色皿中,读取486nm处的吸光度。以丙烯酸含量(?μg)为横坐标,486nm处吸光度为纵坐标,制成标准曲线。将1cm×1cm的待测试样加入染色剂中,读取486nm处的吸光度。对应标准曲线求得PET膜片上接枝丙烯酸含量。1.7标准曲线的绘制在含0.1mg/ml肝素NaCl水溶液0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml的试管中分别加入5.0,4.9,4.8,4.7,4.6,4.5ml?NaCl水溶液(0.2%),使总体积为5.0ml。向各个试管中分别加入1ml甲苯胺兰NaCl水溶液(50mg/ml),混合均匀。各加入1ml正己烷,剧烈震荡30s,吸去上层有机物。读取水层在631nm处的吸光度。以肝素含量(?μg)为横坐标,631nm吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。将表面接枝有肝素的PET膜片剪成细条状,在甲苯胺兰NaCl水溶液中浸放2h,加入正己烷震荡后,读取水层在631nm处的吸光度。对照标准曲线求得PET膜片上肝素接枝量。1.8富血小板血浆prp和乙酸异戊酯分离更需规范制备共辐射接枝改性组(PET-PEG400、PET-PEG400-Hep)和逐步接枝改性组(PET-AAc-PEG6000-Hep)PET薄膜数张。将试样经酒精浸泡2min,然后用大量蒸馏水冲洗,再用生理盐水冲洗后,在生理盐水中浸泡24h。从兔心脏取血,加入3.8%柠檬酸钠抗凝剂。血液在硅化试管中于室温下离心10min(1000r/min)。用硅化吸管吸取上层富血小板血浆(PRP)置于硅化试管中,37℃恒温水浴3min。将试样放入新鲜的PRP中,于37℃水浴中孵育1h后取出,用pH7.4的PBS轻轻洗涤样品,然后用2.0%的戊二醛固定(4℃,24h)。固定后,用50%-75%-95%-100%梯度的乙醇逐级脱水各10～15min,再用50%-75%-95%-100%梯度的乙酸异戊酯(第二组分为乙醇)脱水各10～15min。最后进行CO2临界干燥,镀金,扫描电镜观察。2结果与讨论2.1peg对材料表面亲水性的影响图1和图2分别反映的是采用不同分子量和不同接枝浓度的PEG进行接枝反应后,材料表面亲水性变化规律。由图可知接枝PEG分子量越大,接枝浓度越高,PET膜水接触角变化越快,亲水性越明显。2.2紫外辐照时间对接枝激素量的影响图3表示的是接枝PEG时间不同、使用不同分子量PEG空间臂的情况下,在PET表面偶合接枝肝素的量的变化。由图可知肝素接枝量随接枝PEG时间的延长而增大,可间接地反映出PEG的接枝量也随着紫外辐照时间延长而增大。PEG空间臂的延长有利于肝素的接枝,这可能是由于肝素属生物大分子,空间臂的延长有利于减小其在偶合接枝过程中的空间位阻。2.3逐步偶合接枝法在PET表面辐照接枝AAc,利用PEG6000作为空间臂偶合接技Hep。结果如表1所示。与图3中Hep的接枝量相比,采用逐步偶合接枝法在PET表面接枝的肝素量有了明显提高。这可能是由于采用逐步接枝法首先在PET上引入了大量的羧基,为下一步偶合接枝PEG提供了更多的反应位点。并且由于PEG在接枝过程中能够保持分子链的完整性,有利于减小肝素接枝时的空间位阻,而采用共辐照法因为接枝反应具有一定的随机性,所以会影响PEG的接枝量和分子链的完整性,进而影响下一步肝素的接枝反应。2.4pet表面血小板黏合性图4(a)至图4(d)分别为血小板对空白PET、PET-PEG400、PET-PEG400-Hep和PET-AAc-PEG6000-Hep粘附的扫描电镜图片。未改性PET表面血小板粘附数量最多,而且血小板伸出伪足,变形明显。PET-PEG表面血小板粘附数量明显减少,但仍有血小板伸出伪足,说明在PET表面接枝上亲水性的PEG分子链可以有效地阻止血小板向材料表面靠近,但还不能从根本上抑制血小板的粘附变形。而PET-PEG400-Hep和PET-AAc-PEG6000-Hep由于表面接枝了抗凝血药物肝素,在材料表面粘附的血小板不仅较PET和PET-PEG少,而且血小板的形态也保持完好,没有伪足和变形。说明在材料表面引入肝素可以很好地提高材料的抗凝血性能