结球甘蓝boexu基因克隆及序列分析

结球甘蓝boexu基因克隆及序列分析

花粉发芽和花粉管生长有许多复杂的过程。花粉管中的微丝束与花粉管长轴平行排列,微丝骨架组织的变化、肌动蛋白结合蛋白活性的调节都会影响花粉萌发及花粉管顶端生长(孙颖等,2001)。经研究发现延伸因子中的eEF1α(eukaryoticelongationfactor1alpha)可通过结合微管(Durao&Cyr,1994;Dursoetal.,1996)和切割微管(Shiinaetal.,1994)调节细胞骨架结构,细胞骨架的重排影响上游信号因子的活性,从而参与信号的传导。延伸因子(elongationfactor)是参与蛋白翻译延伸的重要蛋白质,它们通过在核糖体上催化氨基酸链的延伸而推动、控制蛋白质的合成。原核生物的延伸因子为EF-T(包括EF-Tu和EF-Ts)和EF-G;真核生物的延伸因子为eEF-l[包括eEF1A(α)、eEF1Bα、eEF1Bβ和eEF1Bγ4个亚基]和eEF-2(覃迎姿等,2009)。研究发现真核生物细胞器延伸因子与细菌延伸因子EF-Tu的同源性高于胞质延伸因子eEF1A(Gray,1992),因此在真核生物细胞器中与eEF1A相对应的仍被称为EF-Tu。自20世纪60年代从大肠杆菌(E.coli)细胞中首先分离获得延伸因子以来,在过去50多年对延伸因子的研究中,发现EF-Tu是细胞内与翻译机制有关的蛋白质中含量最高的蛋白,在原核生物以及植物线粒体和质体等细胞的蛋白质合成延伸阶段发挥着重要的作用,除此之外在生长信号传导、抗热、抗旱、抗病等方面也表现出非常重要的作用(Fuetal.,2012)。自交不亲和(self-incompatibility,SI)过程中花粉萌发和花粉管生长发育过程涉及到多种信号分子(孙梓健等,2012a)。虞美人SI反应信号可诱导花粉管肌动蛋白骨架重排,V型肌动蛋白网结构丧失,花粉管后段的肌动蛋白束逐渐解散形成斑点,花粉管停止生长,与单纯花粉管生长抑制时微丝骨架的变化方式不同(Geitmannetal.,2000),可见影响微丝骨架重排可能与SI信号引起的胞质游离钙浓度的特异性变化有关。对eEF1α的研究发现除了参与翻译控制有关的信号传导外,在体内和体外eEF1α均能同肌动蛋白纤维及微管蛋白结合,抑制肌动蛋白的聚合速度,稳定肌动蛋白纤维,参与细胞生长、应激反应及运动性有关的信号传导。目前关于延伸因子是否参与自交不亲和花粉萌发及花粉管生长的信号调节,还不清楚。因此探索翻译延伸因子在其花粉萌发和花粉管生长信号传导中的作用具有重要意义。在研究结球甘蓝花粉萌发前后蛋白表达谱中发现了很多差异蛋白,并对相关蛋白进行了研究,如钙调素相关蛋白(孙梓健等,2012a)、膜联蛋白(孙梓健等,2012b)等。本试验中在以往研究基础之上,发现翻译延伸因子BoEF-Tu蛋白表达上调,通过同源扩增克隆得到BoEF-Tu基因及其全长序列,并对其序列结构进行分析,为进一步研究翻译延伸因子EF-Tu的功能及其调控方式奠定分子基础,也为丰富自交不亲和信号传导网络研究提供可行的参考。1材料和方法1.1b提供试验于2011年4月至2012年5月在西南大学重庆市蔬菜学重点实验室完成。以结球甘蓝高度自交不亲和系E1的成熟花粉为材料(由西南大学十字花科蔬菜研究所提供)。蛋白抽提试剂盒和IPG胶条购自Bio-Rad,胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司,DNA连接酶购自东洋纺,限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司,DNAMarker、pEASY-Bluntsimplevector载体试剂盒、反转录试剂盒及TaqDNA聚合酶均购自Transgen公司,Trizol购自Invitrogen,引物合成及测序由北京六合华大基因公司完成,其他常规试剂均为国产分析纯。1.2花粉总蛋白的纯化在相对湿度100%条件下,将收集的自交不亲和系花粉静置培养2h后置于花粉液体萌发培养基中(Robertsetal.,1983),25℃培养1h。将成熟未萌发以及萌发1h后的花粉分别进行离心收集,采用ProteinExtractionKit(Bio-Rad,163-2086)抽提总蛋白,2-DCleanupKit(Bio-Rad,163-2130)纯化总蛋白,除去酚类等杂质,最后使用Bradford法定量(Fermentas,#R1271),置于–80℃保存。经过纯化的花粉总蛋白第一向等电聚焦使用Bio-rad17cmIPG4~7非线性胶条,在PROTEANII(Bio-Rad)上进行,蛋白上样量为60μg·gel-1,等电聚焦条件为:250V1h;3000V2h;8000V2h;10000V恒压至100000Vh。第二向SDS电泳条件:10mA·gel-1,25min;15mA·gel-1至电泳结束,银染法染色。1.3race试验pcr扩增使用Trizol法提取未萌发和萌发花粉混合样品总RNA用于基因克隆和实时荧光定量分析,DNaseI去除总RNA样品中的gDNA,用PrimeScriptRT-PCRKit合成第一链cDNA。根据双向电泳质谱鉴定结果以及参照拟南芥EF-Tu的核苷酸序列设计引物对BoEF-Tu-F(5′-AAACTGCAAAGCGTCACTA-3′)和BoEF-Tu-R(5′-TGTCACCAGGCATAACCAT-3′)用于cDNA序列片段的扩增。RT-PCR扩增体系为ddH2O32uf06dL,10×PCR缓冲液5uf06dL,2mmol·L-1dNTPs5uf06dL,25mmol·L-1MgSO43uf06dL,BoCML-F/BoCML-R各1.5uf06dL,KODDNA聚合酶1uf06dL,模板DNA1uf06dL。PCR扩增参数为94℃2min,98℃10s,46℃30s,68℃1min;35个循环。回收目的片段分别连接到pEASY-Bluntsimple克隆载体,并转化至大肠杆菌感受态细胞JM109,取阳性克隆进行酶切鉴定并送测序。使用SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKitUserManual试剂盒,根据测序得到的序列信息设计RACE引物BoEF-Tu-F-3(5′-CAGGCTGGTGACAATGTTGGACTTC-3′)/BoEF-Tu-R-5(5′-GGAACACCAACCTGACGGGCAAGT-3′)。RACE试验PCR扩增体系为ddH2O12.75uf06dL,10×LATaqPCR缓冲液2.5uf06dL,2.5mmol·L-1dNTP4uf06dL,UPM引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)2.5uf06dL,BoEF-Tu-F-3/BoEF-Tu-R-5(10mmol·L-1)各1uf06dL,LATaqDNA聚合酶0.25uf06dL,模板DNA1uf06dL。PCR扩增参数为94℃3min;94℃30s,72℃3min,5个循环;94℃30s,70℃30s,72℃3min,5个循环;94℃30s,68℃30s,72℃3min,21个循环。1.4功能结构的分析根据克隆得到的BoEF-Tu的cDNA读框序列,使用VectorNTI软件进行预测得到氨基酸残基序列,然后根据其他植物EF-Tu蛋白的分析(Fuetal.,2012)对BoEF-Tu的功能结构域进行注释。将预测得到的BoEF-Tu序列与从GenBank数据库检索到的拟南芥等部分蛋白延长因子家族氨基酸序列经ClustalX2比对后通过MEGA软件构件系统发生树。1.5boef-tu基因表达分析分别收集成熟萌发和未萌发的花粉样本。实时荧光定量RT-PCR试验方法采用LivakMethod(2-ΔΔCt)在C1000ThermalCycler(Bio-Rad)上进行。试验以β-Actin为内参基因(BoActin-F:TATCAACTACCAGCCACC/BoActin-R:GAACACCTCAGCTACACTC),BoEF-Tu基因表达分析引物为BoEF-Tu-F-q(ACTTCAGGGCACAAACGAT)/BoEF-Tu-R-q(TCAAGCACACGAACAGGGTC),参照SsoFastTMEvaGreenSupermix(Bio-Rad)试剂盒配制反应体系,扩增条件为:95℃30s;95℃10s,53.9℃30s,72℃15s,40个循环。每个取样点设3个技术重复,3个生物学重复。2结果与分析2.1花粉的出现与萌发对分别提取的甘蓝成熟花粉与萌发花粉总蛋白进行双向电泳,结果经PDquest软件分析蛋白差异点。在成熟花粉中未出现的蛋白点(图1,A,箭头),在萌发后的花粉中出现(图1,B,箭头)。对该上调蛋白点进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析,结果显示该蛋白点(ProteinID:gi|332656852|)分子量49.6kD,等电点6.68,序列覆盖率(SequenceCoverage)22.03%,蛋白质得分(Prot.Score/ionscore)226⁄65,与拟南芥ElongationfactorTu蛋白具有较高的同源性,命名为BoEF-Tu。2.2f-tu-f和boef-r在蓝莓花粉中的扩增根据蛋白双向电泳质谱鉴定结果,以结球甘蓝花粉总RNA反转录cDNA为模板,使用引物BoEF-Tu-F和BoEF-Tu-R在甘蓝花粉中扩增得到867bp的片段(图2,A)。在此基础上设计5′RACE和3′RACE引物,扩增得到662bp(图2,B,包含UPM引物片段)的5uf0a2端片段和633bp(图2,C,包含UPM引物片段)的3′端片段。2.3boef-tu蛋白序列及同源建模通过同源克隆及RACE等拼接扩增产物,得到结球甘蓝BoEF-Tu的基因序列,全长1728bp,GenBank登录号JQ639089.1,GC含量44.85%,含有完整开放阅读框(ORF),位于112~1473bp,3uf0a2非翻译区255bp,5uf0a2非翻译区111bp,加尾信号(AATAAA)位于第301bp处(图3)。根据其cDNA序列推导得到BoEF-Tu蛋白由453个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸80个,碱性氨基酸63个,分子量为49.17kD,等电点为6.52。对BoEF-Tu蛋白进行在线模型分析(/),氨基酸同源建模(图4,图5),结果表明,此蛋白含有9个α–螺旋结构,分别位于21~22、53~61、80~93、103~105、142~151、170~180、199~215、229~234、240~254位氨基酸残基处;含有18个β–折叠结构,分别位于氨基酸序列的117~119、122~126、157~162、185~191、225~227、275~278、283~295、299~304、312~320、334~338、350~353、363~371、389~394、397~402、409~411、416~422、433~437、441~451位氨基酸残基处。2.4阿斯塔纳的阿斯塔纳分布cvi-pcr蛋白序列筛选从GenBank数据库检索已登录的BoEF-Tu蛋白的氨基酸序列进行同源性比对,发现BoEF-Tu与拟南芥EF-TuM(CAA61511.1)、水稻EF-Tu(AAM74563.1)、蓖麻EF-Tu(XP_002524809.1)、玉米EF-TuM(AAG32661.1)、秋藻EF-TuM(XP_001418116.1)的同源性分别为93%、88%、86%、78%和76%。为进一步研究EF-Tu蛋白的进化关系,从NCBI数据库中搜索EF-Tu的氨基酸序列,经ClustalX2比对,通过MEGA4构件系统进化树(图6)。从图6中可以看出,结球甘蓝BoEF-Tu蛋白与拟南芥(X89227.1、NP_192202.1)最先聚为一类,亲缘关系最近。2.5boef-tu在花粉萌发前后纳米平台上的表达水平采用实时荧光定量PCR技术分析表达量(图7)。结果表明,BoEF-Tu基因在花粉萌发后45min时的表达量为花粉萌发前的2.6倍,表明BoEF-Tu在花粉萌发中后期表达上调,这与双向电泳结果相同。3boef-tu的变化EF-Tu作为在细菌和植物器官细胞如质体和线粒体中蛋白质合成延长阶段发挥重要作用的一种蛋白,具有高度的保守型,其表达受发育时期、激素和环境胁迫(包括高温、低温、光照、高盐、干旱及污染物)等因素的诱导(Risticetal.,1991,1999;Singhetal.,2004;Momcilovic&Ristic,2007)。线粒体、质体和胞质翻译延伸因子EF-Tu都有各自确定的表达模式,其中线粒体EF-Tu基因的表达在花发育过程中却不尽统一。Lee等(2002)发现水稻线粒体EF-Tu的表达高峰出现在花发育的早期阶段,在花的成熟阶段表达量降低。本研究对甘蓝萌发的花粉提取总蛋白,通过双向电泳差异点质谱分析发现萌发花粉中EF-Tu蛋白的表达明显上调,表明在花粉萌发和花粉管生长过程EF-Tu蛋白被大量诱导积累,通过RT-PCR和RACE方法从甘蓝萌发花粉中扩增得到了翻译延伸因子EF-Tu的完整cDNA序列,全长1728bp,编码453个氨基酸,具有翻译延伸因子所特有的3个结构域(GTP结合区域的结构域I以及结合tRNA的结构域Ⅱ和Ⅲ),不含信号肽和跨膜区,并且在线粒体中存在的可能性较高,这也与水稻线粒体tufM基因全长1726bp,编码453个氨基酸的研究结果相似(Leeetal.,2002),因此推测BoEF-Tu属于线粒体EF-Tu基因家族。Fu等(2012)研究发现E.coli细胞中的EF-Tu与水稻和拟南芥的质体EF-Tu分别具有67%和80%的相似性。本研究中氨基酸序列同源性比对也发现BoEF-Tu与拟南芥EF-Tu