泥同工酶的结构和表达分析

泥同工酶的结构和表达分析

1泥基因表达的选择性研究它通常被称为血卟、粒虫、花混合物。这是雅维诺科的一个分支。分布在内湾海滩，有淡水、平坦、水流顺畅的沼泽。它生活在洞穴里。它是一个重要的经济鱼类。由于其丰富的营养成分和优美的口感，它深受人们的喜爱。目前，这项研究主要集中在组织、繁殖技术和种子栽培上，对生化遗传的研究较少。于子牛等人研究了五种组织中的不同异质酶，但不同组织的表型没有太大的不同。在本研究中，采用聚吡咯电泳法对五种组织中的19种同工酶进行检测和分析，以了解不同组织的遗传特征。为探索贝类研究提供了一些理论参考，并对其他组织的遗传特征、物种识别和生物进化进行了研究。2材料和方法2.1组织的解剖泥蚶样本取自浙江省海洋水产养殖研究所.泥蚶壳长度为2.2～2.7cm,把活体带回实验室,取其中的15～20个个体立即解剖,取外套膜、闭壳肌、足、鳃、消化腺等5种组织,-70℃低温冰箱保存.2.2方法2.2.1离心酶提取法将准确称取的5种组织,蒸馏水漂洗后,以1∶3的比例(体重与体积之比)加入0.05%巯基乙醇,冰浴下匀浆,4℃冷冻离心机中12000r/min离心30min(消化腺离心2次或更多次,直至提取的酶液纯清)取上清,加入适量溴酚兰后分装,样品放入-70℃低温冰箱中保存备用.2.2.2电泳酶类及有关系统采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法.分离胶浓度为8.2%(pH8.9),浓缩胶浓度为3.6%(pH6.7),电泳在4℃冰箱中进行.TG系统恒压230V,TC系统恒压80V,EBT系统恒压140V,电泳时间为5～6h.实验所测酶类及有关系统见表1.同工酶的显色方法均见参考文献本文略作改动.染色完毕后用7.5%冰醋酸溶液固定,生物电泳图像系统进行摄影记录.电泳酶谱分析见参考文献.2.2.3酶谱带鉴定以各种酶谱的相对迁移率Rf由小到大依次命名,即向阳极运动的酶谱带开始依次命名为1,2,3,…Rf=l/L,l为阴极端至各谱带中点的距离,L为阴极端至指示剂终点的距离.3酶类活性鉴定本实验共检测了19种同工酶,如表1所示.其中过氧化氢酶、甲酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、D-葡萄糖脱氢酶等4种酶未显示任何有活性的区带,磷酸-6-葡萄糖脱氢酶和谷氨酸脱氢酶只显示很微弱且不稳定的区带,α-淀粉酶、酸性磷酸酶只在消化腺中存在有明显的谱带,而其他种酶类则在各个组织中都显示出清晰稳定的图谱(见图1,2).3.1表面活性剂mdh的抗氧化酶活性MDH是细胞中三羧酸循环中重要的脱氢酶之一,三羧酸循环对于任何一机体都起着重要的作用.由图1可见,泥蚶的苹果酸脱氢酶分布较广,在5种组织中均存在较强的活性区带,即MDH-1,2,3,4,5,6,但不同组织谱带相对活性存在明显不同,MDH在闭壳肌、足中的染色最深,这与肌肉收缩需要大量能量,在柠檬酸循环过程中MDH把苹果酸转为草酰乙酸有关.3.2me的活性分类泥蚶的苹果酸酶存在2～4条谱带,其中ME-1和4在各个组织中都存在,而ME-2,3只存在于足、闭壳肌组织和消化腺中,泥蚶各组织中的苹果酸酶不仅存在谱带数的差异,在活性上也存在较明显的差别,但不管是数量上还是活性上消化腺中的苹果酸酶的表达都是占优势的,其次是足组织.鱼类的ME可分为细胞质型(s-ME)和线粒体型(m-ME),其中m-ME由一个基因位点编码,为四聚体产物,在电泳图谱上迁移较慢;s-ME也只有一个基因位点编码,本研究揭示泥蚶的ME与鱼类一样,也有s-ME和m-ME,但在酶谱上与鱼类略有差异.3.3消化腺的代谢活性泥蚶的酯酶表型较复杂,有13条酶带明显分为5个区域,各组织有5～12条酶带,其中EST-1,2,5仅存在于鳃和消化腺中,EST-3只存在于鳃组织,而EST-6只存在于外套膜、鳃和消化腺中,EST-7,8,9也仅在消化腺中表达.从图1可见消化腺的酯酶最复杂有12条带,而且表现出的酶活性也最强,这与酯酶的生理功能是一致的.EST是催化酯类化合物水解并进入中间代谢的重要酶类,其作用除维持细胞正常的能量代谢外,还能水解大量非生理正常存在的酯类化合物,被认为可能与机体的解毒作用密切相关.消化腺是泥蚶重要的消化器官,同时也是机体最重要的解毒器官,泥蚶中EST-7,8,9酶带仅存于消化腺中,因而可能与解毒的代谢活动有关.3.4sod的分布SOD酶谱较简单,各组织均表现出4条酶带,但在活性上略有差别,其中闭壳肌和消化腺中的SOD较其他组织略强.SOD是生物体防御氧化损伤的重要酶类,当生物体受到外界病原体侵染后,体内自由基浓度将升高,而SOD能清除体内过多的自由基,以免除其对自身细胞的毒害.消化腺是较易受到外界病原体侵害或不利因素影响的组织,这恰与消化腺中SOD同工酶活性高于其他组织相适应.另外一般认为SOD有两个座位控制,分二聚体的s-SOD(上清液型)和四聚体的m-SOD(线粒体型)两类,在相同的电泳条件下,s-SOD因是可溶性的,从而在上清液中酶含量较高而易于检测出来,且迁移较快;而m-SOD常因难溶于上清液中使上清液中酶含量较低而难检测出.结合以上特征,本研究的SOD所得的谱带很可能是s-SOD,至于其位点控制情况还有待于进一步探讨.3.5带数量和活性泥蚶的乳酸脱氢酶的活性较弱,表现为两条酶带,酶带数量上各组织间无显著差异,其中LDH-1很微弱,LDH-2则较强.在活性上足组织表达较强,这可能与足肌纤维收缩时需要大量的能量供应有关.3.6pod的表达泥蚶的过氧化物酶各组织有3～5条带,明显的分为4个区域.其中POD-3,5仅存在于消化腺中,在酶的表达活性上消化腺表达略强.植物的POD一般被认为是由一个位点控制的单体或二聚体酶;鱼类POD的亚基组成尚未清楚.从已有的研究结果来看,有的鱼类POD被认为是二聚体酶,有的则认为是单体酶,还有的认为是四聚体酶.对于泥蚶POD的位点控制情况及其亚基组成情况怎样还有待于进一步研究.3.7鱼类idh的活性泥蚶的异柠檬酸脱氢酶有4条区带,其中m-IDH-1较容易失活,储存较长时间的样品不宜检测到,有关IDH同工酶部分酶带失活的现象在其他生物体中也有过类似报道.在IDH谱带上各组织无显著差异,仅活性上略有差别.一般鱼类IDH分为细胞质型(s-IDH)和线粒体型(m-IDH),m-IDH由一个基因位点编码,在电泳图谱上表型为1条带,迁移慢;s-IDH由两个基因位点编码,表型为3条带,迁移快.泥蚶的IDH酶谱表型上与之相似,但结合泥蚶的居群分析资料(将另文发表)表明,泥蚶的IDH同工酶实际是受两个位点控制的,IDH-2,3,4三条酶带是一个位点的杂合形式,这与姜建国等对草鱼同工酶的研究结果相似.3.8泥和鱼类的adh活性差异泥蚶的醇脱氢酶相对简单,只有两条靠的非常近的区带,各组织间没有显著差异,在活性上也只有足组织稍微低一点.一般来讲鱼类的ADH是由一个基因位点编码的二聚体,由两个基因位点编码的二聚体酶的情形也有报道.从本研究来看泥蚶的ADH酶谱与后者相类似.3.9泥消化腺消化腺泥蚶的淀粉酶只在消化腺中有所表达,在其他各组织中均无表达活性,呈两条白色带,而未见粉红、红褐色等有色条带.淀粉酶的这种分布与泥蚶消化腺所担负的生理功能是相一致的.泥蚶是滤食性贝类,以各种藻类为生,因此消化腺中存在的高强度的淀粉酶也是其消化器官对食物中存在着的淀粉物质的一种适应.3.10酶带的检测泥蚶的山梨醇脱氢酶比较简单,只存在1条酶带.在5种组织中只有足不显示任何有活性的区带,而在其他组织中都有较强的酶带.目前对于山梨醇脱氢酶的生理功能等方面的研究还不多,因此泥蚶的足组织为何无此酶活性还有待于进一步研究.3.11酸性磷酸酶的测定泥蚶的酸性磷酸酶的表达与淀粉酶相似,只在消化腺中有明显的条带,而在其他组织中均不表达.酸性磷酸酶是一种在酸性条件下水解各种磷酸酯的酶,动物的消化腺是主管食物降解消化吸收的地方,因此消化腺中需要大量的酸性磷酸酶的存在,是对消化腺生理功能的适应.3.12琥珀酸脱氢酶scd，e.c.1.3.99.1泥蚶的琥珀酸脱氢酶在各组织中表达较一致,都为1条酶带,而且迁移率相同,在表达活性上也没有显著差异.3.13水生动物酶alp的酶学研究泥蚶的碱性磷酸酶相对较简单,只有1条酶带,各组织之间无显著差异,只在活性上略有不同.目前对于水生生物的ALP研究较少.有资料表明鱼类和贝类的ALP可能是由两个基因位点编码的单聚体和二聚体酶.本研究只发现了1条酶带,因此推测泥蚶的ALP是由一个基因位点编码的单聚体或二聚体酶.4泥体内的同工酶(1)从以上结果可以看出,在泥蚶的5种组织中已存在相当丰富和完整的酶系统,它们不仅以同工酶的形式参与代谢和调节,而且在表型、分布和活性上均表现出高度的组织特异性.从检测到的有稳定基因表达的13种酶的种类来看,几乎涵盖了所有脊椎动物体中所存在的常见的同工酶种类,所涉及的代谢途径也与高等动物的相类似.说明泥蚶已具备了与高等动物相类似的机体代谢方式.从这些酶的分布来看,许多酶都表现出了组织分布的“不均匀性”,这种不均匀性不仅与各组织的不同生理分工相一致,如淀粉酶只存在消化腺中.EST在消化腺中表达最强,LDH在足中活性最高等,而且也与机体对自身基因表达进行调控相联系.(2)在所检测的19种同工酶系统中,过氧化氢酶、甲酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、D-葡糖脱氢酶等4种酶未见表达,其中过氧化氢酶是生物体内重要的抗氧化防御性功能酶,与机体的免疫机能密切相关,因而与SOD一起作为生物体的保护系统而被广泛地研究.目前已在许多种动物体内检测到了CAT活性的存在,包括一些重要的鱼类和经济贝类,但本研究虽然检测到了较强活性的SOD同工酶,但未见CAT同工酶的表达,这是否说明泥蚶体内确实不存在这种酶系统或该酶的浓度低于检出值,还是说明所选的凝胶系统不合适,或是本身酶系统容易失活而未能检出还有待于今后的研究,但从以往的研究来看,在几种机体防御性同工酶中,动物体缺少其中的一种或两种同工酶的现象也是很正常的.至于D-葡糖脱氢酶、甲酸脱氢酶及半乳糖脱氢酶的研究目前在水生生物上报道较少,尤其在贝类上未见相关报道.笔者们对这3种同工酶作了尝试,但均未见酶的表达活性.另外,磷酸-6-葡萄糖脱氢酶和谷氨酸脱氢酶也是参与机体代谢的非常重要的两种酶类,这两种酶在鱼类及其他高等动物中普遍存在.其中磷酸-6-葡萄糖脱氢酶是糖代谢中磷酸戊糖途径的关键酶,而该途径与生物体内脂肪酸、固醇类物质的合成及核酸代谢均有着密切的关系.谷氨酸脱氢酶是催化体内氨基酸氧化脱氨基作用的酶之一,它的活性与蛋白质合成与分解有着直接的关系,在泥蚶中这两种酶表达的都很弱或不稳定,这说明泥蚶体内这两种同工酶所控制的代谢活动的水平都较低.当然也不排除另外一种可能,即在采集样品的时侯泥蚶所处的生理状态正好是这两种酶所参与的代谢途径处于水平较低的时候,当然,要作出正确判断还需结合不同发育时期泥蚶的同工酶表达资料.另外,ADH也是一种重要的酶类,它的生理作用是适应厌氧酵解的需要.该酶的活性较大,在氧气供应不足的情况下,就不会造成因缺氧三羧酸循环受到阻碍,导致丙酮酸的过量积累而使动物中毒死亡.在泥蚶中ADH的活性相当高且很稳定,它和LDH一起使得泥蚶能够适应低氧的泥栖生活.但这与对马氏珠母贝、合浦珠母贝、大珠母贝及三角帆蚌的研究结果不一样,这些贝类中ADH的活性很弱或根本无活性,这是否说明泥蚶比它们更适应水环境生活还有待于进一步研究.(3)在同工酶表型和基因座位上,泥蚶与高等脊椎动物有着相似的遗传性状,如前所述ADH,IDH等.但泥蚶作为在分类阶元上较低等的贝类,其同工酶表型又表现出与之分类地位相一致的特征,LDH是一种适应厌氧呼吸的一种酶类被广泛用于生物的亲缘关系、系统分类、进化理论和种群遗传分析等研究领域.在鱼类、鸟类、哺乳类中LDH均由A,B,C3个基因编码,其中A,B两个位点产物在多数组织中存在,而C位点表达具有组织特异性.因此在一般组织中就会形成典型的5条酶带表型,而泥蚶的LDH则较简单,只显示两条酶带,其中1条较强,1条较弱,反应出其较低等的一面.但同时LDH的这种表型在贝类中也是少见的,与喻子牛等对魁蚶及李广丽等对马氏珠母贝和合浦珠母贝的研究结果不同,也不同于邵健忠等对三角帆蚌的研究,即LDH只有1条酶带,由一个位点LDH-A控制,从而表现出其较特殊的一面.邵健忠等认为LDH只有到了鱼类这个阶段才出现了B基因,在软体动物中还未出现,本研究中泥蚶的LDH出现了两条带,对应