利用分子标记构建结球甘蓝抗病基因饱和遗传图谱

利用分子标记构建结球甘蓝抗病基因饱和遗传图谱

结球甘草是我国重要的蔬菜品种之一。甘蓝根肿病是由芸苔根肿菌(PlamodiophorabrassicaeWoron.)侵染引起的一种世界性真菌病害。近年来,该病在我国的发病面积急剧增加,造成甘蓝产量和品质大幅度降低,选育抗病品种成为防治根肿病的重要途径之一。因甘蓝对根肿病抗性属于数量性状遗传,由多基因控制,易受环境影响。利用常规育种方法改良甘蓝对根肿病的抗性非常缓慢,很难满足农业生产和市场的需要。如果选用分子标记构建甘蓝抗病基因饱和遗传图谱,把大量甘蓝抗病虫基因或数量性状位点(quantitativetraitlocus,QTL)定位在染色体上,在此基础上进行精细定位和克隆单个QTL,再利用分子标记辅助育种,将给传统育种带来革命性的变化。到目前为止,甘蓝类作物的遗传图谱己构建了十几张,绝大多数标记为RFLP标记,其次是RAPD标记,还有少量同工酶标记以及SCAR和STS等基于PCR的标记,大多对抗根肿病育种意义不大。本研究的目的就是在不同的环境下,利用不同的鉴定方法对甘蓝材料进行抗根肿病鉴定,同时选用SSR标记初步构建甘蓝抗根肿病的分子连锁图谱,为进一步的根肿病基因定位和分子标记辅助选择奠定基础。1材料和方法1.1试验材料以抗根肿病自交系R15和感根肿病自交系S14组配的180个F2单株做为作图群体。1.2提取的dna甘蓝叶片DNA的提取采取改良的CTAB法。1.3ssr-pcr检测dna2)、50.00μmol/LdNTPs、0.40UTaqDNA聚合酶、0.4μmol/LSSR引物、1μLDNA(60.00ng/μL),加ddH2O至终体积10.00μL。SSR-PCR扩增程序为94℃变性45S,60℃退火,72℃延伸1min,每个循环低0.5℃,20个循环;94℃变性45S,55℃退火45S,72℃延伸1min,15个循环;72℃延伸10min,4℃保存。反应产物进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后用硝酸银染色。1.4多带型的标记统计在亲本之间产生多态性,并且在F2群体中有分离的条带。记载原则是:抗病亲本用A表示,感病亲本用B表示。对于共显性标记,如果带型和A相同,则记为1,如果带型和B相同,则记为2,如果带型为杂合型,则记为3,缺失带型,则记为0;对于显性标记,如果B对A显性,B带型和F1带型无法区别,将B带型和F1带型作为一种带型,记为4,不出现带型记为1。反之,如果A对B显性,A带型和F1带型无法区别,将A带型和F1带型作为一种带型,记为5,不出现带型记为2。对所有F2单株带型,共显性标记按孟德尔比例1∶2∶1,显性标记按3∶1进行χ2检验。1.5分子标记遗传图谱的建立图谱构建分析所用软件为MAPMAKER/EXP3.0,用group命令(LOD≥3.0,重组率小于50)把所有标记划分为可能的连锁群,用sequence选定后再用compare命令排序,最后用try命令确定个别标记的位置,采用Kosambi函数将重组值转换成图距(cenntiMorgan,cM),确定相应的连锁群并依次建立分子标记遗传连锁图谱,并用MapDraw软件将图谱信息绘制成连锁遗传图谱。2结果与分析2.1引物的筛选本试验共选用了95对SSR引物,筛选出两亲本15R和14S间表现多态性的引物60对,多态性引物比例为63.2%,其中共显性标记55个,显性标记5个。2.2孟德尔分离比例对引物的检测利用60对SSR引物,对180个F2单株作图群体进行标记基因型检测,对所有F2单株带型按孟德尔分离比例,共显性按1∶2∶1,显性标记按3∶1进行χ2试验。51对引物的试验结果符合1∶2∶1结果,为共显性标记,4对引物的试验结果不符合1∶2∶1结果,偏离孟德尔分离比例,偏分离比率为6.7%。5对引物的试验结果符合3∶1结果,为显性标记(表1)。2.3蓝蓝染色体系与蓝细胞标记间的距离分布利用Mapmaker/Exp3.0进行连锁分析时,其中有4个SSR标记没连锁上。其余52个标记分布于甘蓝的9条染色体上,覆盖甘蓝基因组653.2cM,标记间平均距离为12.56cM(图1)。引物OL10-F06对F2作图群体基因型检测表现为共显性(图2),引物OL10-D03对F2作图群体基因型检测表现为显性(图3)。3遗传图谱的大小一般认为,一个基本的染色体连锁框架图要求标记间平均距离不大于20cM,如果构建连锁图谱的目的是为了进行主效基因定位,其平均距离要求在10～20cM或更小。用于QTL定位的连锁其平均距离要求在10cM以下,如果为了基因克隆,则要求目标区域标记的平均距离在1cM以下。据报道B.olercea图谱长度一般在800～1100cM左右,本研究得到的甘蓝遗传图谱总长度为653.3cM,明显小于Landry等(1112cM,201个标记)和Camargo等(1002cM,112个标记)利用亚种间F2代所构建的图谱。本研究所构建的图谱比Voorrips等(615cM,92个标记)利用亚种间DH群体所构建的图谱长度要长。图谱大小除与基因组大小有关外,尚与所用的群体种类有关。遗传图谱大小的差异反映了作图群体双亲间遗传差异的大小,当双亲间遗传距离大,差异位点多,且在染色上均匀分布时,构建的遗传图谱较长,更接近基因组实际大小。本研究为了获得抗根肿病完整遗传信息,所使用的双亲是15R和14S两个结球甘蓝栽培种