饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化周映华;吴胜莲;贺月林缪东【期刊名称】《《湖南农业科学》》【年(卷)，期】2010(000)011【总页数】3页(P21-23)【关键词】枯草芽孢杆菌;培养基;发酵条件;优化【作者】周映华;吴胜莲;贺月林;缪东【作者单位】湖南省微生物研究所湖南长沙410009【正文语种】中文【中图分类】S816.3枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)基我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多的研制成微生物制剂。其制剂是无毒、无残留、无污染的〃绿色”添加剂，具有广阔的发展前景，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用，显示出了巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促进生长起到重要作用。目前在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。笔者对枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行了研究，以期提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种供试菌种为枯草芽孢杆菌，由湖南省微生物研究所菌种保藏室提供。1.1.2培养基检测培养基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，葡萄糖1%，氯化钠0.5%,琼脂2%；种子培养基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，氯化钠0.5%,pH7.0~7.2;基础发酵培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%。pH均调为7.0~7.2。1.1.3仪器设备供试仪器：SHP-250生化培养箱、1600倍微生物显微镜、PHS—25型数显酸度计、福玛QYC—211摇床、电热鼓风干燥箱等。1.2方法1.2.1发酵培养基的优化采用四因素三水平L9（34）的正交实验，对枯草芽孢杆菌发酵培养24h后，通过稀释平板计数法测定活菌数，芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较。光密度（OD600）值测定采用光电比浊计数法，以活菌数的高低作为评价培养基优劣的指标。1.2.2发酵条件的优化（1）温度对生长量的影响：选取20、25、30、35、37、40OC6个温度作为摇床发酵温度，在初始pH7.0，转速220r/min条件下培养24h，测定其OD600值。（2）起始pH值对生长量的影响：将培养基的初始pH调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0，在接种量5%，温度30C,转速220r/min条件下培养24h，测定其OD600值。（3）转速对生长量的影响：选取150、200、220、250、300r/min5个转速，在发酵液初始pH7.2，温度30C条件下培养24h，测定其OD600值。（4）接种量对生长量的影响：选取接种量1%、3%、5%、7%、10%、15%，在30C,初始pH7.2，转速220r/min条件培养24h，测定其OD600值。1.2.3发酵罐试验在摇瓶优化的基础上，进行了20L发酵罐的扩大培养。发酵培养条件为：初始pH7.0~7.2，温度30°C，转速220r/min,121°C灭菌30min,起始气流量比l：0.5。镜检芽孢率达到85%以上时，发酵结束。2结果与分析2.1发酵培养基的优化由表1可见，对枯草芽孢杆菌发酵影响的次序为：豆粕〉淀粉〉葡萄糖>硫酸锰，即豆粕对菌体增殖的影响最大，其次是淀粉、葡萄糖，最后为硫酸锰。优化后的发酵培养基为：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、3.08%硫酸锰0.2ml、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%。表1正交试验处理123456789I活菌数（108个/mL）3.102.2712.64.400.720.394.850.853.56芽孢率（%）>80>80>80>80>80>80>80>80>80jHjmjKjIj/Kjnj/Kjmj/KjDj葡萄糖（%）0.500.500.501.001.001.001.501.501.5017.975.519.263.005.991.843.094.15淀粉（%）00.150.3000.150.3000.150.3012.353.8416.553.004.121.285.524.24豆粕（%）1.002.003.002.001.003.003.001.002.004.6710.2317.843.001.563.415.954.39硫酸锰（%）00.100.200.2000.100.100.2007.387.5117.853.002.462.505.953.49 2.2发酵条件的优化2.2.1温度对生长量的影响由图1可见，在20~30C时，随着温度的升高，OD600值升高。在30C时OD600值最大，高于30C时，OD600值反而下降，因而枯草芽孢杆菌的最适生长温度为30C。图1不同温度对枯草芽孢杆菌生长量的影响2.2.2起始pH值对生长量的影响发酵过程中pH难以控制，一般控制发酵液的初始pH。由图2可见，枯草芽孢杆菌的适宜pH范围为7.0~7.2。2.2.3转速对生长量的影响枯草芽孢杆菌是需氧菌，通过改变转速可以调节通气量。转速太小，通气量小，不利于菌体生长，转速太大时，菌体生长量反而减少。由图3可见，随着转速的提高，OD600值升高。超过220r/min后，其OD600值反而下降。枯草芽孢杆菌的最适转速为220r/min。图2不同pH对枯草芽孢杆菌生长量的影响图3不同转速对枯草芽孢杆菌生长量的影响2.2.4接种量对生长量的影响由图4可见，随着接种量的增加，其OD600值升高，超过10%的接种量后，OD600值反而下降，因此枯草芽孢杆菌的最适接种量为10%。图4不同接种量对生长量的影响2.3发酵罐试验发酵罐试验结果表明：发酵周期与摇瓶发酵基本一致，含菌量达1.58x1010个/mL,放罐时间20~22h。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此菌体浓度和芽孢形成率都比摇瓶发酵好。3结论采用正交实验法对枯草芽孢杆菌的培养基进行了优化，通过稀释平板计数法测定其培养24h后的活菌数，以活菌数的高低作为评价培养基优劣的指标。优化后的培养基为：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、3.08%硫酸锰0.2mL。并通过单因素实验法确定了最佳培养条件为：温度30OC，初始pH7.0~7.2，转速220r/min，接种量10%。进行了发酵罐放大培养，最适放罐时间20-22h,获得的菌体数量约为1.58x1010个/mL,为大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。参考文献：何明清，倪学勤.我国动物微生态制剂研究、开发和应用动态[J].饲料广角，2002，（21）：1-7.周庆安，刘文刚，邓留坤，等.动物微生态剂制及其应用[J].饲料博览，2003，（4）：11-13.李研东.动物微生态制剂的使用现状及应用前景[J].河北畜牧兽医，2005，（4）：48-50.康杰，郎淑妮.概述益生菌的功能及应用[J].贵州畜牧兽医，2008，32（2）：28-29.郝生宏，佟建明，萨仁娜，等.益生菌安全性及其潜在功能研究进展[J].中国畜牧兽医，2004，31（9）：9-12.秦玉昌，潘宝海，于荣，等.芽孢对畜禽生产性能的影响[J].中国饲料，2004，16:8-10.王进华，戚薇，陈莹，等.凝结芽孢杆菌芽孢形成液体