质粒提取与纯化

分子生物学试题(质粒提取与纯化；SSCP部分)一、 填空质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括：非离子型或离子型去圬剂，有机溶剂,碱或加热处理。2•用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0.8X109细胞/ml时，即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以8000r/min为宜。3•在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：可以扩增质粒DNA；抑制了菌体的数量，有利于裂解。常使用的质粒纯化方法都利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状两个性质。由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(SC)的泳动速度最快，一条链断裂的开环状质粒DNA(OC)泳动速度最慢，二条链断裂的线性DNA(L)居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。超离心法纯化质粒DNA时，选用CsCl作介质的优点是：CsCl与不同DNA起反应;CsCl可以自动形成密度梯度，从而使不同分子量的DNA分子得以分开。SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂;溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来;对RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白质结合形成RfO-SO3-・・・R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。8•碱裂解法所用溶液I、II、III的体积比为：2:4:3质粒提取中溶液II的主要成分为SDS和NaOH。溶液III中钾是3mol/L，乙酸根是5mol/LLiCl可沉淀大量蛋白质和高分子RNA。1OD260=50gg质粒DNA/ml。在碱变形法提取质粒DNA实验中，聚乙二醇用于沉淀质粒DNA。残留在DNA样品中的酚可抑制酶的活性。质粒DNA提取中酚的pH值范围是pH7.8—pH8.0o乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有：乙酸铵、氯化钠和乙酸钠。SSCP电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的。影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：甲酰胺点突变对SSCP检出率的影响不仅仅取决于该点在DNA链上的位置，更取决于该位置对维持立体构象作用的大小。二、 选择1•质粒提取中溶液II的主要成分为：BSDS和EDTASDS和NaOHEDTA和NaOHSDS和冰乙酸2•分离质粒DNA时，用蔗糖的目的是：B抑制核酸酶的活性保护DNA，防止断裂加速蛋白质变性有利于细胞破碎关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确？：D溶液I的作用是悬浮菌体溶液II的作用是使DNA变性溶液III的作用是使DNA复性质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性质粒DNA提取中酚的pH值范围：DpH6.5〜pH7.0pH8.0〜pH8.5pH6.8〜pH7.0Ph7.8〜pH8.0CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是：C氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去B.氯化铯可以较多地插入到SCDNA中去EB可以较多地插入到线状DNA中去EB可以较多地插入到SCDNA中去6•同一种质粒DNA,以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是:BOCDNA>SCDNA>LDNASCDNA>LDNA>OCDNALDNA>OCDNA.SCDNASCDNA>OCDNA>LDNA用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C染色体DNA断成了碎片染色体DNA分子量大，而不能释放染色体变性后来不及复性染色体未同蛋白质分开而沉淀10D26o相当于每毫升质粒DNA：A50》g100》g50ng100ng加入溶液III后出现的白色絮状沉淀不包括：A质粒DNA和小分子量RNA染色体DNA和高分子量RNA钾离子和SDS蛋白质和细胞膜SSCP电泳方式为：D普通琼脂糖凝胶电泳低熔点琼脂糖凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：BA.EDTA甲酰胺溴酚兰Tris-HCl12. SSCP分离单链DNA片段是依据：B单链DNA分子量大小单链DNA片段空间构象的立体位阻大小单链DNA带电量的大小单链DNA分子量和带电量的大小三、 是非迄今发现的质粒都是环状的。（错）质粒DNA提取时，溶液II需新鲜配置。（对）如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。（对）碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（错）CsCl-EB密度梯度离心法纯化SCDNA原理是根据EB可以较多地插入到SCDNA中，因而沉降速度较快。（错）酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（对）碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（错）酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）SSCP对长链DNA或RNA的点突变检出率要比短链的高。（错）SSCP分析中非变性PAG电泳分离不能反映出分子量的大小。（对）SSCP可以检测出所有的单点突变。（错）点突变对SSCP检出率的影响取决于该点在DNA链上的位置，点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来。（错）四、 简答1.简述溶液I、II、III所包含成分及生化作用原理溶液I含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基），另外,EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶液II含NaOH和SDS,核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的，但当pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2N，加入抽提液液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性。SDS是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合成为R1-O-SO3—R2+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用Rnase去除RNA时）受到干扰。溶液III是NaAc-Hac的缓冲液（pH4.8）。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液pH调回中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3MnaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。2．小量制备质粒DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化DNA。3．溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？添加DTT、"巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。4．从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，它还能溶解带有长poly（A）段的RNA分子。使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液可以使这两个问题迎刃而解，）5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1-0.25M?在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。LiCl在质粒DNA提取中的作用是什么？沉淀大量蛋白质和高分子RNA。简述PCR-SSCP基本过程。1） PCR扩增靶DNA；2） 将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；3） 将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4） 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断DNA片段中有碱基突变。简述RNA-SSCP的基本原理。RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。SSCP图谱一般是二条单链DNA带，有时可能只呈现一条SSDNA带或三条以上的原因是什么？