食源性致病菌沙门氏菌与奇异变形杆菌二重PCR检测方法的建立

食源性致病菌沙门氏菌与奇异变形杆菌二重PCR检测方法的

建立张海霞;孙桂珍;王慧;孙振红【摘要】目的建立快速检测食物中致病菌奇异变形杆菌与沙门氏菌的双重PCR方法.方法根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)和沙门氏菌属侵袭性抗原保守基因(invA)设计特异性引物，建立其双重PCR检测方法，并对反应条件进行优化.结果两对引物分别能扩增出374bp和724bp的目的条带，具有高度特异性，反应条件优化后，两菌可同时检出的浓度限度为104cfu/ml.结论该方法特异性和灵敏度高，检验周期短，可用于对食物中奇异变形杆菌与沙门氏菌的快速诊检和监控.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷)，期】2014(035)003【总页数】3页(P165-167)【关键词】奇异变形杆菌;沙门氏菌;二重PCR;建立【作者】张海霞;孙桂珍;王慧;孙振红【作者单位】山东农业大学校医院;山东农业大学校医院;山东农业大学动物医学院,山东泰安271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安271018【正文语种】中文【中图分类】Q789沙门氏菌和奇异变形杆菌是食品污染的常见致病菌，主要通过食品、饮水感染人类，导致细菌性食物中毒、肠热症、败血症等，甚至死亡。近年来，有少量文献报道奇异变形杆菌与沙门氏菌属具有共同抗原，能够与沙门氏菌属的多价血清和因子血清发生交叉凝集，引起菌种鉴定上的困难［1-2］。随着分子生物学检测的发展，尤其是在常规PCR的基础上发展起来的多重PCR检测技术，为实现多种致病菌的快速同时检测提供了广阔的发展空间［3］。因此本研究在常规PCR［4-6］检测奇异变形杆菌和沙门氏菌的基础上，通过优化PCR条件，建立其双重PCR检测体系，为快速同时检测奇异变形杆菌和沙门氏菌提供了新的有效手段。1材料与方法1.1材料菌株：奇异变形杆菌1株、沙门氏菌1株、普通变形杆菌1株、大肠杆菌1株、金黄色葡萄球菌1株、单核细胞增生性李斯特菌1株、蜡样芽孢杆菌1株，均由本实验室保存。主要试剂：rTaq、MgCl2、dNTP、10xPCRBuffer、Marker均购自北京全式金公司。引物：所用引物列于表1。以奇异变形杆菌的ureR基因和沙门氏菌的invA基因为研究对象,根据GenBank中基因序列应用Primer5.0引物设计软件设计两对特异性引物。引物均由南京金斯瑞科技有限公司合成。1.2方法1.2.1细菌的培养和模板的制备分别挑取奇异变形杆菌和沙门氏菌两株标准菌单菌落接种于LB培养基,37^振荡过夜培养。对菌落进行平板计数，配制108cfu/ml浓度两种细菌菌液，CTAB法［7］提取DNA。表1引物序列及扩增产物菌种目的基因NCBI注册号引物序列扩增长度(bp)奇异变形杆菌ureRAM942759上游5'-TTGGCGAGATTGAGTGCG-3'下游3'-GCACTATTTGGCGGTCGT-5374沙门氏菌invACP001363上游5'-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3'下游3'-TCCTACAATAAGCGTTTCCC-57241.2.2单一PCR扩增及特异性和敏感性分析先对2种菌进行单独扩增，反应体系为25pl,分别为：10xTaq酶buffer2.5pl,MgCl2溶液2.0W，上、下游弓物各1pl(25pmol/L),dNTP2pl(2.5mmol/L),模板DNA2pl,Taq酶0.3pl(5U/pl),其余用去离子水补足。PCR扩增条件：预变性95^5min;每个循环条件为94°C变性30s,54°C退火30s,72°C延伸50s,30个循环；产物末端72°C延伸10min。PCR扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中，100V电泳40min后，观察产物条带。阳性克隆后送往南京金斯瑞科技有限公司进行核甘酸序列测定，与GenBank中发表的相应序列进行比较。PCR特异性：奇异变形杆菌DNA模板分别加入ureR弓物和invA引物，沙门氏菌DNA模板分别加入invA弓物和ureR引物进行扩增。PCR敏感性：分别将配制好的108cfu/ml浓度的两种细菌菌液，无菌操作按10倍递增稀释至浓度为108~101,CTAB法分别提取DNA，进行PCR检测，能检出的最低细菌浓度为该体系的灵敏度。1.2.3单管多重PCR反应及反应体系的优化模板DNA4pl(2种菌各2pl),引物4pl(2种引物各2pl),dNTP2pl,Taq酶0.3pl,10xTaq酶buffer2pl,MgCl2溶液3pl,其余用去离子水补足，总体积25pl,扩增条件同上。多重PCR体系的优化采取固定其它因素，改变某一因素的方式，设计L16(43)正交试验，对影响多重PCR结果的扩增条件，如Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、退火温度等进行优化，以确定最佳的PCR反应条件。1.2.4PCR特异性和敏感性测定PCR特异性：两两混合1.1.1节中介绍的7种细菌，CTAB法分别提取DNA，在优化的多重PCR体系条件下扩增，进行特异性分析。PCR敏感性：将配制好的的108cfu/ml浓度的两种细菌菌液，无菌操作按10倍递增稀释,使菌液浓度为107~101cfu/ml。取各相同浓度菌液1ml混合，后用CTAB法提取DNA,进行PCR检测后，计算检出限。1.2.5人工模拟样品的检测采用人工模拟污染经检测2种菌为阴性的肉馅样品，将2种菌的菌悬液10倍递增稀释至含菌量在10~1000cfu/ml后，与肉馅混合，人工染菌的肉馅样品以1：10加入相应的LB增菌液中，过夜培养后,CTAB法提取DNA，将以相同方法和时间制备的2种菌模板混合成为混合模板，进行PCR检测，同时对培养液进行培养计数。2结果2.1单一PCR扩增和核甘酸序列分析奇异变形杆菌与沙门氏菌模板DNA在加入各自的弓物扩增时，分别得到预计的PCR产物片段，即374bp和724bp。经克隆测序，奇异变形杆菌扩增片段与GenBank中AM942759ureR基因序列同源性为98.9%，沙门氏菌扩增片段与GenBank中CP001363invA基因序列同源性为99.6%。2.2单一PCR特异性和敏感性分析奇异变形杆菌模板DNA用invA弓物扩增，沙门氏菌模板DNA用ureR弓物扩增，均为阴性（图1）。PCR检测奇异变形杆菌的灵敏度达到了103cfu/ml（图2A）,PCR检测沙门氏菌的灵敏度达到了104cfu/m1（图2B）。M:DNAmarker;1:ureR扩增奇异变形杆菌模板DNA;2:ureR扩增沙门菌模板DNA;3:invA扩增沙门菌模板DNA;4:invA扩增沙门菌模板DNA;5:阴性对照图1奇异变形杆菌、沙门氏菌单一PCR方法特异性检测结果图2A奇异变形杆菌单一PCR方法敏感性检测结果（M:DNAmarker;1~8:奇异变形杆菌菌液浓度依次为108~101cfu/ml;9:阴性对照）图2B沙门菌单一PCR方法敏感性检测结果（M:DNAmarker;1-8:沙门菌菌液浓度依次为108~101cfu/ml;9:阴性对照）2.3单管多重PCR的扩增及其条件的优化初步条件下在同一试管中可同时扩增2种目的基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳显示在374bp和724bp处有2条明显的条带存在。经试验优化得到如下的反应体系：模板DNA4pl（2种菌各2时、上下游弓物4pl（2种引物各2|jl）、dNTP2.5pl（2.5mmol/L）、Taq酶0.5pl（5U/pl）.10xTaq酶buffer2.5pl、MgCl2溶液3pl,其余用去离子水补足，总体积25pl。PCR扩增条件同单重PCR。2.4PCR特异性和敏感性测定结果7种菌两两混合后，结果发现只有奇异变形杆菌和沙门氏菌出现特异性条带，而其它7种细菌均为阴性（图3）。从图4可以看出，在108~104cfu/ml浓度下，两菌均可同时扩增出较清晰条带（奇异变形杆菌在103cfu/ml浓度下仍然可见到条带），与单重PCR灵敏度一致，方法可取。M:DNAmarker;1:奇异变形杆菌和普通变形杆菌；2:沙门菌和大肠杆菌；3:奇异变形杆菌和沙门氏菌；4:金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；5:单核细胞增生性李斯特菌和蜡样芽孢杆菌；6普通变形杆菌和大肠杆菌；7大肠杆菌和单核细胞增生性李斯特菌；8:大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌；9:阴性对照图3奇异变形杆菌、沙门菌二重PCR方法特异性检测结果M:DNAmarker；1-8:菌液浓度依次为108~101cfu/ml；9:阴性对照图4奇异变形杆菌、沙门菌二重PCR方法敏感性检测结果2.5人工模拟结果人工染菌肉馅中，染菌量在每克样品中奇异变形杆菌含量83cfu,沙门菌含量40cfu。经过增菌培养后，菌量分别达到奇异变形杆菌7.4x108cfu/ml，沙门菌4.4x107cfu/ml,运用前面的多重PCR体系进行检测，能够扩增出相应的特异性条带。实验证明人工染菌的样品能够同时检测出所接种的致病菌，并且无非特异性扩增，说明该多重PCR检测方法对食品中存在的奇异变形杆菌和沙门菌有很好的特异性和敏感性。3讨论多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，可同时检测多种病原微生物，具有高效、高产、低成本、速度快等优点，目前已在多种病原微生物的检测中得到初步的应用［8-11］。本研究在参考别人研究的基础上，尝试用多重PCR检测奇异变形杆菌和沙门氏菌。目的基因的筛选对PCR的特异性非常重要。奇异变形杆菌的ureR基因编码奇异变形杆菌脲酶调节子，林红乐等［12］通过对2株奇异变形杆菌、14株非奇异变形杆菌以及60份食物中毒送检标本进行检测，显示该基因具有很高的特异性。沙门氏菌的invA基因编码吸附和侵袭上皮细胞的表面抗原，李业鹏等［13］对77株沙门菌和24株非沙门菌进行检测，表明该基因也有很高的特异性。这都在本实验中得到了进一步的证实。同时，引物设计时已排除PCR扩增产物间可能发生的错配，避免引物对间形成黏性末端或部分双链，并对反应体系中各成分的使用量、比例、反应条件进行了优化，摸索出了最佳退火温度、引物浓度等，使实验达到了最佳效果。本研究初步建立了快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系，实现了对多种病原体DNA的同步快速扩增，为病原微生物的鉴定提供了快速、灵敏、特异的检测方法，具有较强的应用价值。进一步规范后可研制成检测试剂盒，从而为致病微生物检测试剂盒的推广应用奠定基础。参考文献：［1］张元芳，钟小东,王顺东，等.三株与沙门菌有共同抗原的奇异变形杆菌的检出与分析［J］.中国卫生检验杂志,2003,13:788-789.王锦彤，钟广辉,熊定凯，等.珠江水中检出与沙门氏菌具有共同抗原的奇异变形杆菌[J].口岸卫生控制,2007,13(2):23-24.张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用[J].中国卫生检验杂志,2008,18(5):958-960.MansyMS,FadlAA,AshourMS,etal.AmplificationofProteusmirabilischromosomalDNAusingthepolymerasechainreaction[J].MolCellProbes,1999,13(2):133-1401.LimanskiA,MinukhinV,LimanskaiaO,etal.Species-specificdetectionofProteusvulgarisandProteusmirabilisbythepolymerasechainreaction[J].ZhMikrobiolEpidemiolImmunobiol,2005,3:33-39.CharlottaLfstrom,RickardKnutsson,CharlottaEngdahlAxelsson,etal.RapidandSpecificDetectionofSalmonellaspp.inAnimalFeedSamplesbyPCRafterCultureEnrichment[J].Appl.Environ.Microbiol,2004,70:69-75.AusubelFM,BrentR,Kingst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