飞跃中的基因技术

湖南中医药大学

生物技术论文学生姓名： 刘婷学号：200904090135学院： 药学院专业年级： 09食品科学与工程 题目：飞跃中的基因技术乳酸发酵评阅教师：曾老师2011年5月飞跃中的基因技术一乳酸发酵

摘要：乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。常添加在酸奶之内。采用了基因工程研究方法，建立乳酸菌基因表达系统，从基因水平改进产品质地，对天然的乳酸菌进行改良，将对人类健康密切相关的基因（如转铁蛋白，乳铁蛋白，GST等基因）在乳酸菌中分泌表达，制备对人类健康具有明确医疗保健作用的乳酸菌饮料。关键词：基因技术发酵剂食品级酶异源蛋白质基因突变关键步骤1绪论1.1发展历史20世纪80年代以来基因工程技术已经开始在乳酸发酵剂领域进行研究了，利用基因工程技术改造传统的发酵食品用微生物是当前食品生物技术领域的一个新的研究热点。近10年来，基因工程技术主要应用于乳酸发酵工业以下几个方面:噬菌体抗性菌株的分子育种；质粒相关的稳定作用；增强干酪的风味和质构，加速干酪的成熟；细菌素和其它天然抗生素的产生；生物胶的产生；风味缺陷的控制；益生素的产生；食品级酶和异源蛋白质的产生；降低莫兹瑞拉干酪的棕色化；发展适用于低脂防乳制品的发酵剂；发展冷敏感型发酵剂。大多数发酵食品中含有未灭活的发酵微生物，并随食品进入人体，因此利用基因重组技术改造食品用微生物时，首先应保证具有足

够的安全性。有了食品级基因修饰菌的明确定义，美国、荷兰、丹麦等国的研究人员作了大量有关用基因工程技术改良乳制品发酵剂的研究，而这个领域的研究在国内仍属于空白。本文的目的就在于将当前国际上利用基因工程修饰、改变传统乳制品发酵剂的研究现状进行总结，以促进国内食品生物技术的发展。1.2现状生物技术应用于食品有着悠久的历史，随着生物技术的蓬勃发展，对于促进食品的发展有着巨大的贡献。近年来基因工程技术的发展为食品提供了新的发展契机。为世界所面临的粮食短缺以及品质要求找到了新的解决途径。也为食品工业提供营养丰富的动植物原材料、性能优良的微生物菌种以及高活而价格适宜的酶制剂，而且还可以赋予食品多种功能、优化生产工艺和开发新型功能性食品。所以，基因工程正在使食品业发生着深刻的变革。而基因工程技术改造传统的发酵食品用微生物是当前食品生物技术领域的一个新的研究热点，倍受大家的关注。2基因技术在乳酸菌中的应用原理。2.1乳酸菌的基因工程育种。我们大家都知道：乳酸菌是一类能代谢产生乳酸，降低发酵产品pH值的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达2种类型，其中受控表达系统包括糖诱导系统到安全、丰富、营养的食品到安全、丰富、营养的食品诱导系统、pH诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言，德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏，但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。乳酸菌基因突变有2种方法：第一种方法涉及（同源或异源的）可独立复制的转座子，第二种方法是依赖于克隆的基因组DNA片断和染色体上的同源部位的重组整合而获得的。完整的基因组序列的破译并没有改变这些基本方法，然而这已经极大地提高了选择用于研究基因位点的速度，而且现有的基因组序列大大提高了随机整合体的定位能力和预测遗传前景的能力。食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公认的安全的食品级微生物的基因，并因此而具有某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。其基因修饰过程应满足下列要求：1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全的食品级微生物；2、载体必须是食品级的，不得含有非食品级的功能性DNA片段；3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记，防止抗生素抗性基因随菌体进入人体。应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、营养缺陷型标记等；4、宿主菌的遗传特性清楚且稳定，具有足够的安全性，应选用适当的分子生物学方法如DNA序列分析、杂交等确定宿主菌的遗传组成。3影响乳酸菌发酵剂性能的因素乳制品发酵剂依产品主要可分为奶酪发酵剂、酸奶发酵剂、奶油发酵剂三大类。无论是哪种发酵剂，人们最关注的性能有以下几个方面:产生双乙酰的能力；蛋白水解能力；产生胞外多糖的能力；抗病原菌、杂菌污染能力；抗噬菌体侵染能力。下文将从这几个方面阐述用基因技术改良乳制品发酵剂的思路及研究成果。3.1产双乙酰能力乳制品发酵风味（如黄油，酸奶等）的核心成分是双乙酰。对大多数乳酸菌而言，乳糖分解成为葡萄糖和半乳糖，其经过糖酵解途径转化成丙酮酸，再在乳酸脱氢酶的催化作用下还原，转变为乳酸。少量的丙酮酸在a-乙酰乳酸合成酶的作用下形成不稳定的中间产物a-乙酰乳酸，极易受a-乙酰乳酸脱羧酶作用形成3-羟基-2-丁酮，并最终被缓慢氧化成2,3-丁二醇。一些乳酸菌突变菌株具有很强的双乙酰产生能力，研究证实这些菌株体内没有a-乙酰乳酸脱羧酶。据此可以认为，在没有a-乙酰乳酸脱羧酶存在时，a-乙酰乳酸会积累，在有氧气存在时经化学氧化过程转变成为双乙酰。这也是双乙酰产生的机理。根据此原理，假若使菌株丧失合成a-乙酰乳酸脱羧酶的能力，a-乙酰乳酸会积累，菌株产生双乙酰的能力就会提高。目前工业上广泛应用的产双乙酰能力强的菌株就是a-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型菌株，但是它对噬菌体较敏感，一旦噬菌体浸染发生，没有菌株可以替换它。这才促使人们利用基因工程技术去获得ALD缺陷型菌株。1996年Coupil报道了用基因工程技术筛选ALD缺陷型菌株的方法[7]。该方法的理论基础是a-乙酰乳酸是3-羟基-2-丁酮的前体，也是亮氨酸缬氨酸合成的前体物质；当培养基中存在亮氨酸时，会产生抑制效应，即ALD被激活使a-乙酰乳酸发生脱羧反应，生成3-羟基-2-丁酮；反之，不存在亮氨酸时，ALD没有活性，a-乙酰乳酸不能发生脱羧反应而转向亮氨酸缬氨酸的生物合成。因此当培养基中有亮氨酸而无缬氨酸时，菌体细胞会因缬氨酸缺乏而无法生长。但是ALD缺陷型菌株在有亮氨酸而无缬氨酸基质中培养时，a-乙酰乳酸不会转变成3-羟基-2-丁酮，菌体将正常进行亮氨酸缬氨酸的生物合成，进行各种生命活动。应用此原理筛选ALD缺陷型菌株需有一前提，即菌株要有合成缬氨酸的能力。但是，自然存在的乳酸菌菌株绝大多数已经丧失了这种能力。为此，Curic将携带有缬氨酸合成酶基因的质粒载体PMC004电穿孔法转化到宿主双乙酰乳酸乳球菌中，使其获得合成缬氨酸的能力。Curic的筛选过程为：出发菌株DB0410+质粒PMC004-转化一含亮氨酸的化学合成培养基筛选一能够合成缬氨酸的阳性转化子(DB0410/PMC004,Val+)一ALD缺陷型筛选一DB0410/PMC004,ValALD-一去除质粒PMC004-MC010。最后获得的菌株MC010不含有任何外源DNA，Southern杂交和DNA印记反应证明其基因图谱同野生的L.lactisdiacetylactisDB0410是一样的，因此具有足够的安全性，是一食品级基因修饰菌。用该菌进行强化柠檬酸的M17培养基发酵实验，产酸速度和产酸总量和对照组没有明显差异，而a-乙酰乳酸的产量MC010试制发酵奶油，产品在储藏1d后，双乙酰的浓度高达0.22mol/L,而对照组仅为0.01mol/L，储藏1周后，双乙酰的浓度降为0.04mol/L，对照组仍为0.01mol/L。3.2蛋白水解能力蛋白水解能力是衡量干酪发酵剂的重要指标。发酵剂在干酪的成熟过程中，水解乳蛋白，产生小分子肽和氨基酸，是成熟干酪的重要风味成分。乳酸菌的蛋白水解系统包括结合在细胞壁上的蛋白酶PrtP，其功能是将细胞外的蛋白质水解成寡聚多肽；细胞膜上的寡聚肽转运子OPP，其功能是将寡聚多肽由细胞外转运到细胞内，该步骤是乳酸乳球菌在牛乳中生长的关键步骤，OPP缺陷型的突变株不能在以酪蛋白为唯一氮源的培养基上生长。细胞内蛋白酶，如氨基肽酶pepN，二肽酶pepV，内肽酶pepO，胱氨酸肽酶pepC等，将寡聚多肽最终水解为氨基酸。依据上述理论，国外科学工作者作了一些改良发酵剂蛋白水解能力的尝试。HENRIKSEN等人将pepN，pepV，pepC，pepO蛋白酶基因分别克隆到pFG1质粒中，并分别在L.LactisMG1363中表达，制作成单一菌株的发酵剂，进行50g奶酪的生产实验。结果表明，经4〜6个月的成熟期后，转pepN和pepC基因的发酵剂作成的奶酪；同对照组相比，苦味明显降低，嗜好性味增加；而转pepO和pepV基因的发酵剂同对照组没有明显差异。由于乳酸菌的多数蛋白酶属于胞内酶，因而有人认为在奶酪发酵成熟的过程中，菌体可能会发生裂解，释放胞内酶，进而水解介质中的蛋白质。将噬菌体溶菌酶基因①VML3克隆到PFG1质粒中，并在MG1363中表达，制作成相应的发酵剂和奶酪，结果乳酸菌在奶酪成熟后期的自溶能力显著增强，苦味显著降低，嗜好性味显著增强。3.3胞外多糖的形成在酸奶及其他一些发酵乳制品发酵过程中，乳酸菌产生的胞外多糖可使产品增稠、稳定，质地细腻均匀，口感润滑。乳酸菌分泌胞外多糖的能力很不稳定，即便是在最佳的培养条件下，多次的移接操作或培养时间延长都可能造成菌株分泌胞外多糖能力的丧失。乳酸菌遗传学表明，乳脂乳球菌和乳酸乳球菌合成胞外多糖的关键基因在质粒上，乳酸菌容易丧失分泌胞外多糖的能力是由于质粒的不稳定性造成的。目前遗传特性研究的最为清楚的是源于L.LactisN120b40的质粒pNZ4000，它是一含有多个功能性基因的复合质粒（40kb），其中与胞外多糖合成有关的14个基因构成一个12kb的操纵子。由于胞外多糖对产品黏度与质地的影响是与其分子大小密切相关的，因此从基因水平改进产品质地的另一个思路是提高胞外多糖的分子量。通过控制胞外多糖分子延长基因的表达水平可以实现控制胞外多糖分子大小的目的。研究表明，在胞外多糖的绝对产量不增加的情况下，仅将胞外多糖的分子量提高一倍，就可以使产品的黏度与质地发生显著变化。3.4抗杂菌、病原菌污染特性许多乳酸菌在发酵过程中除产生乳酸、乙酸和双乙酰外，还可产生一些具有抑菌和杀菌作用的细菌素，在食品的防腐保鲜中起重要作用。如目前研究得最彻底、应用最广的有乳酸乳球菌产生的乳链球菌素（Nisin）、乳酸片球菌产生pediocinPA-1、乳酸乳杆菌产生的lactacinF。这些细菌素都是经核糖体合成机制产生的多肽类物质（在这一点上同普通抗生素有本质的区别），产生菌对其细菌素有自身免疫性。分子遗传学研究表明，乳酸乳球菌的Nisin结构基因位于染色体的可结合转座子（70kb）上，其中在10kb的片段上分布着NisA.B.T.Z.P.K基因，构成一个8.5kb的多顺反操纵子，5'端有一核糖体结合位点，3'端有一个终止密码子和依赖P因子的转录终止子。Nisin的前体肽有57个氨基酸组成，其中N端23个残基为信号肽，它在细胞表面会被信号肽酶水解去除，最终释放出成熟的有活性的Nisin。基于上述的研究成果，国外研究者尝试用基因工程技术增强奶酪发酵剂产生Nisin的能力，但结果却不尽人意。产生Nisin的能力提高的同时，乳糖代谢的速度下降，发酵剂的蛋白质水解能力及耐热性也都下降。分析原因，认为奶酪的发酵剂是混合型的，含有多种乳酸菌，产Nisin的菌株对不产Nisin的菌株的生命活动有拮抗作用。Nisin尝试将片球菌素pdiococin基因克隆并在乳酸球菌中表达的试验。Pdiococin-PA-1由乳酸片球菌Pediococcusacidlactici产生，该菌乳糖发酵能力弱，它主要是作为生物防腐剂控制食品中的杂菌和病源菌。Pdiococin-PA-1的相关基因在质粒上，是一个含4个基因的操纵子。将该操纵子克隆并构建成食品级表达载体pMC117质粒，转化到乳酸乳球菌MM214中，得工程菌MM217。以此菌制作成发酵剂，并进行奶酪得生产试验。结果表明，试验组奶酪在发酵1d时含64000Pediocin，6个月后降到2000，而对照组没有检测到Pediocin活性。试验组奶酪的Lister菌数比对照组低1000倍以上。说明该菌产Pediocin能力高，且能有效杀死、抑制Lister菌。同时该发酵剂的糖代谢速度、产酸速度、产品的PH值、水分含量等发酵指标和产品指标同对照组相比都没有明显差异。提高发酵剂抗杂菌污染能力的另一个思路就是将噬菌体编码的细菌细胞壁裂解酶基因导入发酵剂乳酸菌，提高其抗菌能力。将Listeria菌的噬菌体胞壁裂解酶（可专一性水解Lister菌细胞壁肽聚糖的肽键）的操纵子克隆到PTRKH2质粒上，构建成表达载体，导入乳酸乳球菌可实现胞壁裂解酶的成功分泌，使培养基中的Lister菌迅速裂解。4实际应用其中，复旦大学采用了基因工程研究方法，建立乳酸菌基因表达系统，对天然的乳酸菌进行改良，将对人类健康密切相关的基因（如转铁蛋白，乳铁蛋白，GST等基因）在乳酸菌中分泌表达，制备对人类健康具有明确医疗保健作用的乳酸菌饮料。［预期成果和市场前景分析］:建立乳酸菌基因转移表达系统；制备具有特定明确医疗和保健功能的基因工程乳酸菌。被誉为第三代乳酸菌的基因工程乳酸菌具有特定的明确的医疗保健功能，市场前景广阔。例如转铁蛋白和乳铁蛋白则能够明确促进食物中铁的