第十章酶学和酶工程研究今后的方向、进展、热点问题

酶学和酶工程研究今后的

方向、进展、热点问题

二十一世纪是生物学世纪，将在生物学领域有所发明，有所发现。

在酶学和酶工程领域会有哪些进展呢？在21世纪国际酶学和酶工程若干热点和前沿课题的研讨会上科学家提供了一些观点，值得提供给大家。一、基因工程和蛋白质工程的应用 有关基因工程在酶工程领域的研究文章大量涌现。 运用基因工程技术可以有什么好处？

改善原有酶的各种性能， 1.如提高酶的产量、 2.增加酶的稳定性、 3.使酶适应低温环境、 4.提高酶在有机溶剂中的反应效率、 5.使酶在后提取工艺和应用过程中更容易操作等， 6.运用基因工程技术也可以将原来有害的;未经批准的微生物产生的酶的基因;

7.或由生长缓慢的动植物产生的酶的基因，克隆到安全 的、生长迅速的、产量很高的微生物体内，改由微 生物来生产。 8.运用基因工程技术还可以通过增加编码该酶的基因的拷贝数，来提高微生物产生的酶的数量．这一原理已成功地应用于酶制剂的工业生产． 目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司，由原诺和诺德公司酶制剂部独立而成)．生产酶制剂的菌种约有80%是基因工程菌 由基因工程发展起来的蛋白质工程更加吸引人们的广泛关注。在兴起之初，主要采用定点突变技术，

对天然酶蛋白进行改造，已经取得很多成果。例如，将T4溶菌酶的第51位苏氨酸转变成脯氨酸，使该酶对ATP的亲和力增强，酶活力提高了25倍。但定点突变技术只能对天然酶蛋白中某些氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因此对酶的功能的改造非常有限． 不过，如果通过多代遗传将突变积累起来，也可以较好地拓展酶的功能。

近来，Arndd利用所谓“定向酶进化”技术，在试管中模拟达尔文进化论的关键过程。先进行无序突变和重组，继而进行筛选，再通过多代遗传，可以大大改进和拓展酶的功能。 近来国际上又提出酶蛋白全新设计的概念。

众所周知，蛋白质的空间结构由其氨基酸的序列控制，而其功能又与结构密切有关。据计算，300个氨基酸可以组成10390种不同序列的蛋白质。而从生物出现以来，自然界估计有1055种蛋白质．即绝大多数新序列和新功能的蛋白质或酶，在许多亿年的生物进化过程中还没有出现过或者没有研究过的酶，有待我们去开发和创造．

基因工程的飞速发展，我们可以通过研究能够获得自然界原先并不存在的、具有全新结构和功能的蛋白质．同样，这一项新技术也可以用于组建自然界原先并不存在的、结构和功能全新酶蛋白。在确定设计目标后，先根据一定规则产生初始序列，经过结构预测和构建模型，对序列进行初步的修改，然后进行基因表达或多肽合成，再经结构检测，确定是否与原定目标相符。并根据检测结果，指导进一步的设计。尽管目前对蛋白质全新设计的理论基础，即蛋白质折叠规律的认识还不够深入，蛋白质全新设计还处在探索阶段，但定，其应用前景非常诱人，值得深入探索和研究二、酶在环境治理方面的应用研究 当前，环境污染己经成为制约人类社会发展的重要因素．我国每年排出大量废水(416亿吨)废气和烟尘(2000万吨)，以及固体废弃物(1000亿吨)，污染规模达到相当严重的地步．美国也有大量土地、淡水和海水区域被污染。据估计，仅治理被污染的土地一项，就耗资巨大。

原先人们常用的化学方法和物理方法，己经很难达到完全清除污染物的目的。

微生物在环境治理方面发挥了十分巨大的作用，最常用、最成熟的活性污泥废水处理技术，就是依靠了微生物的作用、同样，各种微生物酶能够分解糖类、脂肪、蛋白质，纤维素、木质素;环烃、芳香烃、有机磷农药、氰化物、某些人工合成的聚合物等，正成为环境保护领域研究的一个热点课题．三、人工合成酶和模拟酶

酶的高度催化活性以及酶在工业上应用带来巨大经济效益，促使人们研究人工合成的酶型催化剂．

通常，人们将人工合成时具有类似酶活性的聚物称之为人工合成酶。

人工合成酶在结构上必具有两个特殊部位，即一个是底物结合位点，一是催化位点。 已经发现，构建底物结合位点比较容易，而构建催化位点比较困难．两个位点可以分设计。

但是已经发现，如果人工合成酶有一个反应过渡态的结合位点，则该位点常常会同时具有结合位点和催化位点的功能．人工合成酶通常也遵循Michaelis-Menten方程，例如高分子聚合物聚-4-乙烯基吡啶-烷化物，具有糜蛋白酶的功能，含辅基或不含辅基的高分子聚合物，具有氧化还原酶、参与光合作用的酶和各种水解酶等功能。

在“模拟酶”方面，固氮酶的模拟最令人瞩目。人们从天然固氮酶由铁蛋白和铁钼蛋白两种成分组成得到启发，提出了多种固氮酶模型。

如过渡金属(铁、钴、镍等)的氮络合物，过渡金属(钒、钛等）的氮化物，石墨络合物，过渡金属的氨基酸络合物等;此外，利用铜、铁、钴等金属的络合物，可以模拟过氧化氢酶等． 近来，国际上又发展起一种分子压印技术，又称为生物压印(bidimprinting)技术。该技术可以借助模板在高分子物质上形成特异的识别位点和催化位点。目前，此项技术已经获得广泛的应用。例如，模拟酶可用于催化反应，分子压印的聚合物可用作特制的分离材料，

抗体和受体结合位点的模拟物可用于识别和检测系统，分子压印的聚合物可用作生物传感器的识别单元。 有专家在演讲中介绍了人工合成酶在氧化还原反应方面的进展。他将天然酶和人工合成酶置于膜反应器内，比较了二者在连续氧化还原反应系统中的反应能力。 转换频率 空间时间产率天然酶 高低人工合成酶． 低 高在使用有机溶剂和各式各样不同的底物方面，人工合成酶也要比天然酶优越得多．四.核酸酶抗体酶 近年来，人们发现去除蛋白质的RNA和DNA也具有催化功能，1982年Cech发现四膜虫的26SrRNA的前体，在没有蛋白质存在的情况下，能够进行内含子的自我剪接，形成成熟的rRNA，证明RNA分子具有催化功能，并将其称为核酸酶,也有人称为核酶)。1995年Cuenoud又发现某些DNA分子也具有催化功能，改变了只有蛋白质才能有催化功能的传统观念，也为先有核酸，后有蛋白质，提供了进化的证据。

进一步研究发现核酸酶是一种多功能的生物催化剂，不仅可以作用于RNA和DNA，而且还可以作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶还可以同时具有信使编码功能和催化功能，实现遗传信息的复制转录和翻译，是生命进化中最简单．最经济最原始的、催化核酸自身复制、加工的方式。 核酸酶具有核苷酸序列的高度专一性．这种专一性使核酸酶具有很大的应用价值。只要知道某种核酸的核苷酸序列，就可以设计并合成出催化其自我切割和断裂的核酸酶。

我们知道，动植物病毒的基因组由核酸组成． 根据这些基因组的全部序列，就可设计并合成出防治一些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶。例：能够防治流感、肝炎及滋病和烟草花叶病等．核酸酶也可以用来治疗某些遗传病和癌症。 核酸酶还可以用作研究核酸图谱和基因表达的工具。一般说来，人工合成的模拟酶与天然酶的催化效率相差较大，且反应类型大都为水解反应。

人们从酶与底物过渡态中间物是酶催化过程中的关键一步得到启发，结合到抗原引起生物体内抗体的合成，以及抗原和抗体的紧密结合，设想考虑利用抗原抗体相互作用原理来模拟酶的催化作用。人们设想以一些底物过渡态中间物的类似物作半抗原，诱导合成与其结构互补的相应抗体，试图得到能够催化上述物质进行活性反应的酶。1986年这种努力在实验室里获得了成功，为人工合成酶和模拟酶，开创了一条崭新的途径。人们将这种具有催化活性的抗体称为抗体酶)，又称催化抗体。

抗体酶在本质上是免疫球蛋白，人们在其易变区赋予了酶的催化活性。抗体是目前已知的最大的多样性体系，但无催化活性。而抗体酶则具有较高的催化活性。制备抗体酶的方法主要有诱导法、 拷贝法、 插入法、 化学修饰法 基因工程法。

抗体酶的催化效率远比模拟酶高;同时，从原理上讲，只要能找到合适的过渡态类似物，几乎可为任何化学反应提供全新的蛋白质催化剂-抗体酶。

目前抗体酶催化的反应，

除水解反应外，催化合成反应，交换反应，闭环反应，异构化反应、氧化还原反应等。

此外，与模拟酶相比，抗体酶表现出一定程度的底物专一性和立体专一性。业已证明，抗体酶可以在体内执行催化功能。抗体梅的应用前景非常诱人。抗体酶已经用于酶作用机理的研究， 手性药物的合成和拆分， 抗癌药物的制备．

目前人们正在致力于提高抗体酶的作用效率，期望在深入了解酶的作用机理，以及抗体和酶结构和功能的基础上，能够真正按照人们的意愿构建出具有特定催化活性和专一性的催化效率高的能满足各种用途需要的抗体酶．五.分子酶学 研究分子结构和功能的关系．到1999年1月。在Brookhaven蛋白质资料库中己经收集到8000多个蛋白质结构，其中酶的结构有4800个。近年来，多标记和多维技术的发展，使得利用核磁共振检测生物高分子物质的结构成为可能。近年来，利用NMR技术解析酶的研究迅速发展．对某些蛋白质进行动态结构的研究，如测定肌红蛋白。 近来，基因定点突变技术的广泛应用，使酶的结构与功能的关系的研究，将在今后的研究中会取得突破性的进展。六.功能酶学进展 从1990年开始的、被称为生物学的“阿波罗登月计划”的人类基因组计划，是整个生物学领域人力、物力和财投入最大的一项巨大工程。其任务是完成人体23对染色体、约10万个基因、30亿对碱基的DNA的全序列测定，原来计划2005年完成。有美国、日本、中国等国家合作，已经于2000年6月26日公布了人类基因组的基本框架。预计，将在2002年全部完成。

今年4月在上海开的国际人类基因组会议提出，明年上半年公布全部结果，供全世界使用。

2001年2月12日美日英中德等国的科学家和美国的塞莱拉公司，联合公布了在原“工作框架图”基础上经过整理分类和排列而得到的人类基因组图谱和初步分析结果。

每种生物只有一个基因组。但每种生物的不同细胞的蛋白质的组成和数量不同，其功能状态也不同而有很大差异。因此，基因组是唯一的，但基因组内成千上万个基因并不在相同时间内全部得到表达。即使得到表达，其表达程度也各不相同．

当然，基因的表达并非是无序进行的，而是有内在的规律。不同的基因有其各自不同的表达模式．这正是基因调控的结果。基因组研究的根本目的是揭示整个生命活动的规律。

人类基因组全序列的测定完成后，只是解决了人类全部基因DNA序列问题(即遗传信息库问题)， 今后人们必须进一步了解这些基因的功能，以及这些基因如何发挥其功能。因此功能基因组的研究在今后的研究中就非常重要。

实际上，每一种生命活动形式都是由特定的蛋白质类群在不同时间和空间存在，发挥其不同组合功能的综合结果。 基因DNA的序列并不能提供上述全部信息，仅用核酸的语言还不能描述整个生命活动的规律。

在基因表达过程中，还存在基因剪接、蛋白质翻译后修饰及蛋白质剪接，使基因遗传信息的表达规律更加复杂。一个基因对应一个蛋白质的经典理论已经被实践所否定。已发现，一个基因可以表达的蛋白质的数目可能远大于l。对细菌而言，可能表达的蛋白质数目为1.2-1.3;对酵母而言，则为3;而对于人，则可以高达I0。

即人类3.5万个基因表达的蛋白质数目可能高达35万。在基因编码的蛋白质中，酶占了大约为60%。因此，后基因组研究，亦即功能基因组研究中，酶蛋白质组研究的任务极为繁重。七.酶的定向固定化问题 酶固定化以后活性部分失去，甚至全部失去。一般认为酶活性的失去是由于酶蛋白通过几种氨基酸残基在固定化载体上的附着造成的，这些氨基酸残基主要有:赖氨酸的(ε-氨基和N-末端氨基,疏基，天门冬氨酸和谷氨酸的羧基等）。

由于酶蛋白多点附着在载体上用起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增加。这种增加直接导致酶活性下降或者丢失。

近来，国外的研究者们在探索酶蛋白质的固定化技术方面，己经寻找到几条不同途径，使酶蛋白能够以有序方式附着在载体上，有一定的定向作用，而使酶活性的损失降低到最小程度。酶蛋白的固定化技术具有以下一些优点:a.每个酶分子通过其一个特定的位点以可重复的方式进行固定化，b.蛋白质的定向固定化技术有利于进了步研究蛋白质结构c.这种固定化技术可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。

目前所用的方法：1)

借助化学方法的位点专一性固定化;2)

磷蛋白的位点专一性固定化;3)

糖蛋蛋白的位点专一性固定化;4)

抗体(免疫球蛋白)的位点专一性固定化;5)利用基因工程的位点专一性固定化。以及共价固定化、氨基酸置换、疏水定向固定化等

这种有序的、定向固定化技术己经用于生物芯片、生物传感器"、生物反应器、临床诊断药物设计、亲和层析及蛋白质结构和功能的研究。八杂交酶

所谓杂交酶是指由来自两种或两种以上的酶的不同结构片段构建成的新酶。杂交酶的出现及其相关技术的发展，为酶工程的研究和应用开创了一个新的领域。是人们可以利用高度同源的酶之间的杂交， 将一种酶的耐热性、稳定性等非催化特性“转接”给另一种酶。这种杂交是通过相关酶同源区间残基或结构的交换来实现的，

杂交酶的特性通常介于其双亲酶的特性之间。

例如，利用根癌土壤杆菌和淡黄色纤维弧菌的β-葡萄糖苷酶进行杂交，构建成的杂交β-葡萄糖苷酶，其最佳反应条件和对各种多糖的Km值都介于双亲酶之间。2是人们可以创造具有新活性的杂交酶。 其最便捷的途径就是调节现有酶的专一性或催化活性。 现在所有杂交酶大都属于这类酶。有时单个氨基酸残基的变化就能够改变酶的催化活性。如：发酵氨基酸球菌的戊烯二酸辅酶A转移酶点突变后，可以转化成酚基辅酶A烃化酶。 采用循环点突变和筛选技术，经3轮的突变，可构建出高活性的能够将甲基癸酸对硝基苯酯进行手性拆分的杂交脂酶。其酶活性可以从野生型的2%上升到81%。 ` 创造新杂交酶还可以利用功能性结构域的交换，以及向合适的蛋白质骨架引入底物专一性和催化特性的活性位点等技术。

杂交酶技术还可以用于研究酶的结构和功能之间的关系。例如，可以用来确定相关酶之间的差异。 当某个酶的特性在同源酶中缺失时，人们可以用杂交酶技术分析研究与该特性有关的残基或片段等。 近年来，杂交酶的发展非常迅速，1998年就有14个利用杂交酶技术改良的酶，获得了美国专利。可以预期，杂交酶技术必将为酶工程的研究和应用发挥更大的作用。九．极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种研究 自然界蕴藏着巨大的微生物资源． 据测算1g土壤中含有l亿个微生物。美国华盛顿大学的JamesStaley教授说过，未知的微生物世界或许是地球上最大的未开发的自然资源，能够利用这个微生物资源的国家，势必会取得技术上的优势。

自有酶一词以来，随着研究工作的深入，酶的种类在不断增加。到目前为止，还不知道自然界究竟有多少种酶。同样，也不清楚，每个细胞内究竟有多少种酶。 有人估计大肠杆菌细胞中有“3000种蛋白质， 而真核细胞中有50000种蛋白质．这些蛋白质中的大多数是酶。如果估计可靠，酶的种类将达到几万种。近来，人们从生产实践的需要出发，非常重视开发新的酶种。

现在人们对极端环境微生物和不可培养微生物研究还很不够．这两个资源宝库值得人们去开发。

人们首先注意从极端环境条件下生长的微生物内筛选新的酶种。其中主要研究嗜热微生物、 嗜冷微生物、 嗜盐微生物、 嗜酸微生物、 嗜碱微生物、 嗜压微生物等。

目前，人们己经发现能够在250-350℃条件下生长的嗜热微生物，能够在-10-0℃条件下生长的嗜冷微生物，能够在pH2.5条件下生长的嗜酸微生物，