生物化学3核酸

生物化学第二章核酸化学重点：①核苷酸的组成②DNA的一级及空间结构③核酸紫外吸收性质④核酸的变性、复性与杂交。难点：①DNA的空间结构②DNA的生物学功能核酸的组成DNA的结构RNA的结构与功能核酸的性质核酸的生物功能和实践意义一、核酸的组成成分1869Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleicacid）。1952年Hershey等的实验表明32P-DNA可进入噬菌体内，证明DNA是遗传物质。1953Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型，说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系。1958Crick提出遗传信息传递的中心法则核酸的生物学功能（一）DNA是主要的遗传物质（二）RNA生物学功能1.参与蛋白质的合成2.遗传物质3.具有生物催化剂功能4.基因表达与细胞功能的调节

核酸是一种线性大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是由相应核苷酸聚合而成具有一定空间结构的大分子化合物。核苷酸由碱基、糖、和磷酸所组成。脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）:遗传信息的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）：主要参与遗传信息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质(90%)中，少量存在于细胞核(10%)中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）转移RNA（transferRNA，tRNA）信使RNA（messengerRNA，mRNA）小RNA（smallRNA，sRNA）核蛋白磷酸核苷碱基戊糖蛋白质核酸→核苷酸碱基戊糖磷酸嘌呤嘧啶RNA腺嘌呤Ade胞嘧啶Cyt核糖

H3PO4鸟嘌呤Gua尿嘧啶UraDNA腺嘌呤Ade胞嘧啶Cyt脱氧核糖鸟嘌呤Gua胸腺嘧啶Thy1．戊糖（pentose）

β-D-核糖β-D-2-脱氧核糖β-D-2-O-甲基核糖（1）嘌呤碱（purine,Pu）

腺嘌呤鸟嘌呤2．碱基（base）：又称含氮碱

（2）嘧啶碱（pyrimidine,Py）

胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶（3）修饰碱基（modifiedbase）稀有碱基（minorbase）①互变异构现象

酮式烯醇式糖的第一位碳原子与嘧啶的第一位氮原子或嘌呤的第九位氮原子以C-N糖苷键相连。碱基与糖环平面互相垂直。都是β糖苷键。3.核苷天然核苷：一般为反式构象

修饰核苷（modifiednucleoside）：

修饰核苷包括三种情况:

（1）由修饰碱基和糖组成的核苷（2）由非修饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷（3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷假尿苷（

）二氢尿嘧啶（DHU）AmCH3CH3H3Cm26GHH5HH几种稀有核苷腺嘌呤核苷酸（AMP）

Adenosine

monophosphate脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosine

monophosphate鸟嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）HOH4.核苷酸（1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：

2’，3’，5’一核糖核苷酸(2´-AMP)(3´-AMP)(5´-AMP)（2）脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）3’，5’一脱氧核糖核苷酸Deoxyadenosine3’-monphosphate(3’-dAMP)Deoxyadenosine5’-monphosphate(5’-dAMP)（1）一般物理性质（2）互变异构现象4.2核苷酸的性质（3）紫外吸收胞嘧啶核苷酸的解离（4）核苷酸的两性解离和等电点核苷酸的解离曲线pK1=0.9第一磷酸基pK3=6.2第二磷酸基pK2=3.7含氮环腺嘌呤核苷酸pK1=0.7第一磷酸基pK3=6.1第二磷酸基pK2=2.4含氮环烯醇式羟基鸟嘌呤核苷酸pK1=0.8第一磷酸基pK3=6.3第二磷酸基pK2=4.5含氮环胞嘧啶核苷酸pK1=1.0第一磷酸基pK3=6.4第二磷酸基烯醇式羟基尿嘧啶核苷酸pH离子化程度可在pH2.0～5.0之间分离各种核苷酸

pH3.5时各核苷酸所带电荷

核苷酸磷酸基电荷碱基的电荷净电荷AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1ATP类的高能磷酸化合物

核苷酸的重要衍生物细胞中的携能物质（如ATP、GTP、CTP、UTP）二、DNA的结构55333

-5

磷酸二酯键（一）DNA的一级结构

5’→3’DNA一级结构的表示法5´3´结构式5´3´

p

p

p

pOH3´ACTG1´线条式5´

ACTGCATAGCTCGA3´字母式英国Sanger1975年加减法1977年末端终止法

美国Maxam和Gilbert1977年化学断裂法

DNA分子中核苷酸的序列p951971年，吴瑞将引物延伸（primerextension）用于DNA测序。吴瑞发明的联接子（linker）和衔接子（adaptor）迄今仍然是克隆DNA的常用工具他主编的《重组DNA》曾风靡分子生物学和生物技术界。上世纪80年代后，吴瑞在水稻转基因技术上有先导性贡献。吴瑞（1928-2008）吴瑞在分子生物学和植物生物学等领域有重要贡献。酶法（双脱氧法、末端终止法）DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP提出DNA双螺旋结构模型的根据1、x-光衍射分析20世纪40年代Astbury1952年M.Wilkins（二）DNA的二级结构

从这个衍射图可以推测出，DNA可能具有螺旋结构，DNA分子中有0.34nm和3.4nm的周期性结构。2、Chargaff规律1950年（1）所有生物的DNA中，A=T，G=C，A+C=G+T，且A+G=C+T。（2）DNA的碱基组成具有种的特异性。（3）DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。（4）年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。DNA的双螺旋模型特点（1）两条反向平行的多聚核苷酸链形成右手螺旋。（2）碱基对链间碱基按A=T，G≡C碱基互补（3）碱基、糖、磷酸的位置。磷酸和脱氧核糖单位作为骨架位于外侧，作为可变成分的碱基位于内侧。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行；小沟位于双螺旋的互补链之间大沟位于相毗邻的双股之间

（4）大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。（5）大多数天然DNA是双链DNA（dsDNA）DNA双链线状双链环状单链线状：动物病毒MVM单链环状：噬菌体φX174真核细胞染色体DNA噬菌体T2，T5，T7，λ，P22

E-Coli染色体DNA线粒体DNA叶绿体DNA多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA噬菌体λ和φX174的复制型（6）核苷酸序列复杂性和多样性稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）。②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子形成离子键。DNA的双螺旋结构的意义该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。DNA双螺旋的种类

当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时，DNA的构象发生改变。类型结晶状态ANa盐，相对湿度75%时结晶BNa盐，相对湿度92%时结晶C锂盐，相对湿度66%时结晶（1）B-DNA每圈螺旋10个碱基对螺距：3.32nm（2）A-DNA右手螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交（3）Z-DNA左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。d(CpGpCpGpCp­Gp)与基因表达、基因调控有关

三、RNA的结构（一）RNA的一级结构

1．核苷酸之间的连接方式AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体。RNA与DNA的差异

DNARNA糖脱氧核糖核糖碱基

AGCTAGCU不含稀有碱基含稀有碱基（1）转运核糖核酸（transferRNA:tRNA）

tRNA的主要功能是在蛋白质生物合成的过程中，起着转运氨基酸的作用。tRNA约占细胞总RNA的10-15％，一般是由73个－95个核苷酸组成。3．几类RNA的一级结构

tRNAAla1965年

酵母tRNAAlatRNA一级结构的共同点:

①Mr较小（Mr25000），沉降常数4S。②各种tRNA的链长很接近，一般在73～93个核苷酸之间。③tRNA分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的。④各种tRNA的3′端为CCA；5′端大多数为pG，少数为pC。⑤tRNA含有较多的修饰成分。（2）核糖体核糖核酸（ribosomeRNA:rRNA）

rRNA是核糖体的组成成分。

核糖体是细胞内蛋白质和RNA的复合体，是蛋白质合成的场所。核糖体含有大约60％RNA，40％蛋白质。rRNA的一级结构原核生物核糖体70S50S30S5SrRNA，23SrRNA34种蛋白质16SrRNA21种蛋白质真核生物核糖体

80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49种蛋白质18SrRNA33种蛋白质原核生物：5S、16S、23S，分别具有大约120、1540、2900个核苷酸。真核生物：5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。S为沉降系数（sedimentationcoefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。（3）信使核糖核酸（messengerRNA,mRNA）

mRNA编码蛋白质中的氨基酸序列，mRNA作为一个“信使”。mRNA约占细胞总RNA的5％。mRNA的一级结构真核生物mRNA的一级结构可用下式表示:5´-帽子5´-非密码区密码区3´-非密码区polyAAAAAAAA-OH5´

“帽子”PolyA

3´

单顺反子m7G-5´ppp-N-3´p原核细胞mRNA的结构特点5´3´顺反子顺反子顺反子插入顺序插入顺序先导区末端顺序★由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。★没有5´帽子和3´polyA。（二）RNA的二级结构RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。1、tRNA的二级结构★三叶草形★四臂四环酵母tRNAAla

的二级结构DHU环IGC反密码子反密码环氨基酸臂可变环TψC环CCAAla3´5´

1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。四、核酸的物理化学性质1、核酸的一般性质2、核酸的紫外吸收3、核酸的变性、复性及杂交1、一般性质：分子大小、性状、溶解度、酸碱性质

分子大小：DNAMr106～1010或更大性状：DNA为白色纤维状固体而RNA为白色粉末溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。RNAMr104～106或更大酸碱性质DNA等电点4～4.5RNA等电点2～2.5pH小牛胸腺DNA的滴定曲线2、核酸的紫外吸收

λmax=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值2、含量计算260nm光吸收值为1

：50ug/mL双螺旋DNA

或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判断DNA是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数（减色效应）摩尔吸光系数——1mol/L磷的核酸溶液在一定pH和相应波长下，光径为1cm时测得的光吸收值3、核酸的变性、复性及杂交(1)变性★核酸变性概念★变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）射线等★变性后的理化性质：理化性质：紫外吸收↑粘度↓比旋光度↓生物活性：生物活性↓或丧失天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。DNA的Tm一般在82～95℃之间。DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度（Tm）。影响DNA的Tm值的因素①DNA均一性

均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。②G-C含量测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44③介质中离子强度（2）复性（renaturation）

理化性质:↓比旋光度↑粘度↑高于Tm值5℃复性也称退火生物活性得到部分恢复变性DNA在适当（一般低于Tm20～25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。★

DNA的浓度★

DNA片段的大小★温度(3)分子杂交（hybridization）不同来源的单链核酸之间可通过碱基互补形成双螺旋结构。用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交

1975年英国E.M.Southern首创的Southernblotting（Southern印迹）探针：作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段五、核酸生物功能和实践