大肠杆菌表达系统

外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录翻译Ptac=3Ptrp=11Plac启动子转录调控机理

具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）

正调节因子CAP

负调节因子lacI启动子Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统

正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac

介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPLac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。Lac表达系统

负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI

基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于

trp和lacUV5

启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。lac、tac启动子对宿主菌的要求

在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。

当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。lac、tac启动子对宿主菌的要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq

被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。

但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。

需在表达载体中插入lacIq

基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。lac、tac表达系统存在的问题

IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的

毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。

一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG

解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录lac、tac表达系统存在的问题lac和tac启动子的转录受温度严紧调控

把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达启动子Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

Trp表达系统

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效转录mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶PL

和PR

表达系统

以l噬菌体早期转录启动子PL、PR

为核心构建的表达系统

在野生型l噬菌体中，PL、PR

启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。启动子PL

和PR

表达系统

转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI

基因产物的产生和消失是相当困难的。

因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。

在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落PL和PR

表达系统宿主菌中没有cI基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL

或PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。

对宿主菌的要求

用溶源化l噬菌体的大肠杆菌作PL、PR启动子表达载体的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cI857(ts)

l噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。

把cI857(ts)

基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大PL和PR表达系统存在的问题

由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统。

缺陷在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。

T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7表达系统转录调控的机理

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

化学诱导型温度诱导型双质粒系统T7RNA聚合酶T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因？启动子T7表达系统转录调控的机理

化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中

用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为

化学诱导型，类似于Lac表达系统。

T7RNA聚合酶基因

lac

启动子E.Coli（DE3）T7启动子

目的基因T7RNA聚合酶IPTG诱导T7表达系统转录调控的机理

温度诱导型PL

启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。

这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

T7RNA聚合酶基因PL

启动子E.Coli（CE6）T7启动子

目的基因T7RNA聚合酶热诱导cI857T7表达系统转录调控的机理

双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因

两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA聚合酶热诱导T7启动子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

启动子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpRT7表达系统存在的问题

T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。

解决办法之一

在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。营养调控型采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因

phoA启动子或甘油3’-磷酸转移系统ugp

启动子构建表达载体。

这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L时抑制，Pi﹤1mmol/L时激活)，具有较高的转录水平。其他表达系统

糖原调控型采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC)mgl启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动子构建表达载体。

这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于Lac表达系统.其他表达系统pH调控型采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA

启动子构建表达载体。

cadA启动子受培养基中H+浓度，即pH值调控。（在pH﹥8时抑制，pH﹤6时激活，pH=6时转录活力最高）。

该表达系统要求菌体发酵温度控制在27～30℃之间才能使目的基因得到稳定的表达.其他表达系统溶氧调控型采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl

启动子，硝基还原酶基因nirB启动子或透明颤菌血红蛋白基因

vgb

启动子构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子fnr的作用位点。

在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活。其他表达系统溶氧调控型大肠杆菌GJ100有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子控制下的T7RNA聚合酶基因表达质粒，vgb基因的转录是受环境溶氧浓度调控的，在贫氧条件下vgb基因的启动子被激活。

因此，用大肠杆菌GJ100作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧诱导型，菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节，与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。其他表达系统生物素调控型

用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体，菌体生长过程中生物素会不断消耗，当浓度到达2ng/ml以下时启动子被激活。

能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻。其他表达系统强化转录终止的必要性

外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2

以及T7噬菌体DNA上的Tf。

对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）

核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：

位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；

翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子

SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列的影响一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列与起始密码子之间的序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。

紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列与起始密码子之间的距离的影响SD序列与起始密码子AUG

之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。

在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响

起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的

5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位

目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。核糖体结合位点不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多细胞内tRNA的含量密码子生物体对密码子的偏爱性密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响

由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。

一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：

外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降

解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道

外源基因在大肠杆菌中的表达蛋白质的合成是在细胞之中进行的目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的20%～40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：

在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒

包涵体存在于大肠杆菌细胞质中

在细胞内表现为可溶性的蛋白质

可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。大肠杆菌基因工程菌的构建策略

包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的优点在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集

简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的缺点以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。

经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。

能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：

清洗剂SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化

促溶剂盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应

混合溶剂如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强

极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作

包涵体的复性与重折叠（refolding）包涵体的复性与重折叠的主要任务：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性包涵体型异源蛋白的表达在细胞内表现为可溶性的蛋白质目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基，需要形成二硫键的蛋白质大部份被转运到细胞的其他部位。

分泌型异源蛋白的表达

这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因trxB缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明trxB缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化，蛋白质在trxB缺陷株的细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一·个相当重要的工具。分泌型异源蛋白的表达在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质

在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质需要起始密码，通常为编码甲硫氨酸的ATG。⑴在多数情况下，N端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质没有特别的影响，但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物学活力的报道。⑵另外，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质。从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看，这是一个需要引起重视的问题。

去除附加的甲硫氨酸有二种方法：

⑴在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分离纯化后在体外用外肽酶处理。但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨莱酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达

与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高