常用生物化学检验技术一

1临床生物化学检验常用技术

阿克苏地区第二人民医院王霞第三章2第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节干化学分析技术第四节电泳技术第五节基因扩增技术

本章内容概要3教学目标和要求1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。掌握电化学分析方法基本原理2、熟悉分光光度计的基本结构和操作方法光源检查和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的因素。熟悉离子选择电极分类，离子选择电极的分析方法3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中的应用。4第一节光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基本结构分光光度计的操作方法分光光度技术的定性和定量方法5一、光谱分析技术的基本原理：

利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。1、光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法

吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法

散射光谱分析技术：比浊法

6微粒性(E=hv)

波粒二象性波动性(

=c/v)E=hv=hc/

----光的能量与光的波长成反比，与光的频率成正比2、光的基本性质---高速传播的电磁波73、物质对光吸收的基本原理：能量转移

----当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子（原子）与光子发生“碰撞”，光子的能量因此转移至分子（原子）上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。8选择吸收

----组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱。

9能量释放

----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。10E1E0吸收光谱发射光谱激发态基态E1＞E011

（1）根据产生光谱的物质结构原子光谱

(atomicspectrum)

分子光谱

(molecularspectrum)4.分类12（2）根据光谱获得的方式不同①吸收光谱（Absorptionspectrum）分析法：根据溶液能吸收由光源发出的某些波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。

紫外-可见分光光度法

(ultravioletandvisiblespectrophotometry)

原子吸收光谱法

(atomicabsorptionspectrophotometry)

红外光谱法

(infraredspectrometry)13②发射光谱(emissionspectrum)分析法：

根据物质受到热能或电能等的激发后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。原子发射光谱法

(atomicemissionphotometry)

分子发光分析法14

1、定义：

根据被测物质对各种不同波长光的吸收能力，绘制吸收曲线，并根据曲线的特性鉴定物质的方法。

属光谱分析法。二分光光度法15可见光：

400~700nm,有色物质溶液紫外光：

200~400nm,无色物质162、特点：

仪器设备和操作简单费用少，分析速度快灵敏度高(10-4~10-7g/mL)

选择性好精确度和准确度高173、应用：（1）定性分析定性鉴定纯度鉴定

结构分析（2）定量分析18（一）光吸收的基本定律

1、定律：单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。

19

（1）Lambert定律：说明吸收与溶液液层厚度间的关系L1L2入射光透过光入射光透过光L2

＞L1，I1＞I2I0I1I0I220

（2）Beer定律：说明吸收与溶液浓度间的关系21

2、表达式：

-lgI/Io=-lgT=KLC

A=-lgT=KLC

I/Io为透光率(Transmittance,T)A为吸光度(Absorbance)K为吸光系数(absorptivity)L为液层厚度

C为溶液浓度(concentration)摩尔吸光系数ε：当溶液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，K即成为摩尔吸光系数22光源单色器样品室检测器显示1.光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。（二）分光光度计的基本结构232.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。243.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理25（三）分光光度计的类型1.单光束

简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。2.双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。263.双波长

将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△

=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。27仪器

可见分光光度计28仪器

紫外-可见分光光度计29Beckman紫外-可见分光光度计eppendorf紫外-可见分光光度计30（四）分光光度计的操作方法A.分光光度计的基本操作以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。2.将波长旋至测定的波长。3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0。5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.06.重复步骤4和57.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）31B.吸光度的校正

铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。32使用图示 1.开启电源，指示灯亮，仪器预热10分钟，选择开关置于“T”

。2.打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0%T”旋钮，使数字显示为“00.0”。333.将装有溶液的比色皿放置比色架中。4.旋动波长手轮，把测试所需的波长调节至刻度线处。345.盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率“100%T”旋钮，使数字显示为“100.0T”（如果显示不到100%T，则可适当增加灵敏度的档数，同时应重复“2”，调整仪器的“00.0”）。 356.将参比溶液比色皿置于光路中，将选择开关置于A，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为.000，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。368．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关.37三、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法定性依据：最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε2.摩尔吸光系数ε方法1.最大吸收波长λmax方法38（二）分光光度技术的定量方法1.标准曲线法

将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度方法：39AXCXA（吸光度）C（浓度）40制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。（2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。412．比较法

CX=(AX×Cs)/As

己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：

其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。423．其它分析方法

包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。43四、其它光谱分析技术（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（三）荧光光度分析法1．基本原理2．组成1．基本原理2．组成3．原子吸收分光光度法的特点

3．荧光光度定量分析法4．荧光光度分析技术的应用1．基本原理2．影响荧光强度的因素44火焰光度法——等离子体发射光谱法45原子吸收分光光度法46荧光光度法NanoDrop®ND-3300Fluorospectrometer

47第二节电化学分析电化学分析方法基本原理离子选择电极分类离子选择电极的分析方法48电化学分析是利用物质的电化学性质，测定化学电池电位、电流或电量的变化进行分析的方法。电化学分析方法电位分析法：测定原电池电动势以求物质含量的分析方法电导法：通过电阻测定以求物质含量的分析方法电容量分析法：借助某些物理量的突变作为分析重点的指示49电位分析法是利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量的分析方法。一、电化学分析方法基本原理原电池是利用两个电极之间金属性的不同,产生电势差,从而使电