紫外分光光度法的原理

第七章紫外分光光度法的原理和应用一.比色分析的原理：光是一种电磁波，它的波长用nm或Ǻ为单位，人的眼睛所能感觉到的光波长约400～760nm，这之间的光波称为可见光。短于400nm的叫紫外线，短于200nm的叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长于760nm的叫红外线，红外线可长达5mm，再长的就是无线电波了。普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种日光或白炽光通过棱镜可以分解为红、橙、黄、绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处或几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收最多的那部分波长光线的颜色。不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法，如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm

氧化钬的吸收光谱二.郎伯-比尔定律：当一束单色入射光[I0]通过厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的强度[I1]与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的关系：I1=I0·10－K·L·C如果物质在溶液中的浓度和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分析的原理。入射光强度I0透过光强度I1溶液厚度L（比色杯直径）I1=I0·10－K·L·C移项成：I1/I0=10－K·L·C

式中K为常数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=－K·L·C，再以透光度T=I1/I0时，则上式成为IogT=－K·L·C或者－IogT=K·L·C。I1/I0称为透光度或透光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之几，其数值只能＜1，从0~100%。为了方便起见，经常用透光度的负对数－IogT来表示溶液吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度(E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS=K·L·C该式说明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加，则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的比色杯，使用最多的是1cm的比色杯。比色分析中有时也用透光度做单位，根据透光度的负对数－IogT=吸光度，透光率为100%时，吸光度=－Iog1=0，而透光率为1%时，吸光度=－Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律），则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只在一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超过一定限度时，失去正比关系，则不能一概地用比色结果换算，通常都要研究测定方法中什么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现浓度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折，说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用来比色分析。可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数的比浊测定。光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射、光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响，即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。三.可见—紫外分光光度计的应用（一）光谱分析：有时候需要研究某物质在某溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0nm和237.5nm处有吸收波峰。大多数情况下，比色分析都提供了使用光的波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从200～1000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸收峰，再用吸收峰波长来比色分析。咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品（二）吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或εmol表示；如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K称为百分吸光系数，用E%表示。E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征波长或最大吸收波长，表示为Emol~nm,max,1cm或E%~nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料中可以查到，如药典规定VB12应该有278±1nm、361±1nm、550±2nm3个吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可以配成1mmol/L或1μmol/L的浓度，相应地写成Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根据吸光系数的特性，它有3项用途：1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为279±0、361.5±0、550.7±0.3nm3个吸收峰，完全一致，可以判定该物质为VB12（未变质）。一些苯衍生物的紫外光谱特征如下：化合物溶剂吸收峰吸收峰吸收峰Emolmax，1cm苯碳氢化合物254nm2502048800甲苯碳氢化合物2622602087900六甲基苯碳氢化合物27123022110000氯苯碳氢化合物2672002107400苯酚碳氢化合物27112602136200.2.检查纯度：紫外光谱法检查纯度是一种简便有效的方法，用于许多化合物检测。如阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到312nm，只要检测在312nm处是否有吸收峰，即可判断有无水杨酸。再如无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯，测定其吸收光谱，乙醇在210~600nm之间无吸收峰，而苯在250、254nm有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。3.检查含量（纯度）:如药典规定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度为0.512，其含量为：1%∶207=x%∶0.512，x%=0.00247%，浓度=0.00247%×20=0.049%4.应用摩尔吸光系数测定浓度:一般的比色分析中都有标准品，未知样品都是通过和标准溶液对比分析含量。某些情况下，没有标准品，可以用摩尔吸光系数或百分吸光系数进行测定，直接测定溶液的吸光度，通过和该纯物质的吸光系数比较，可以计算出浓度。这样的分析需要经过精确校正了波长的分光光度计，紫外分光光度计的波长一般精确到2nm，可以承担这样的分析。如果知道分子量的话，百分吸光系数和摩尔吸光系数之间可以互相换算，换算公式是：百分吸光系数=10×摩尔吸光系数÷物质的分子量。比如血红蛋白是4个亚基组成的蛋白质，单个亚基的平均分子量是16114.5。每个亚基都在高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和氰化钾[KCN]溶液中形成单体氰化高铁血红蛋白（HiCN），它的特征（最大）吸收峰在540nm处，摩尔吸光系数是11000，表示为Emolmax,540nm,HiCN=11000。测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算出含量。如：将血液0.02ml加入到5.0ml氰化高铁试剂中，用540nm测定的吸光度为0.35，求血液中Hb的含量(g/L)。第一步，计算血液稀释倍数：5.02÷0.02=251（倍）；第二步，计算：1mol∶11000=xmol∶0.35，x=0.35÷11000mol/L，乘以分子量和稀释倍数变为g，x=0.35÷11000×16114.5×251=128.7（g/L）。如果有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同样条件下测定，用百分吸光系数同样可以换算。5.

紫外吸收光谱在某种程度上反映了化合物的性质和结构，所以可以用于有机化合物的定性和结构分析。利用标准样品或标准图谱可以对未知化合物进行鉴定，即控制相同的测量条件，将未知化合物的吸收光谱与标准品或标准图谱进行对照，如果两者吸收光谱的形状、吸收峰的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完全一致，则可说明它们分子结构中存在相同的生色基团，初步确定它们是同一种物质，如咖啡因的定性。由于大多数有机化合物的紫外光谱比较简单，缺乏精细的结构特征，而且很多生色团的吸收峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局限，一般必须与红外光谱、质谱、核磁共振波谱等相配合，才能进行精确的鉴定。6.溶剂对紫外光谱的影响：在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。常用溶剂的波长范围如下：.溶剂使用波长范围溶剂使用波长范围甲醇>210二氯甲烷>235.

乙醇>215氯仿>245.

水>210乙酸乙酯>260.

96%硫酸>210苯>280.

乙醚>215甲苯>285.（三）作为光度计使用：有色的反应液可以用普通的分光光度计（721、722、浓度计），也可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反应液无色，在200～400nm之间有特征性光吸收,就只能用紫外分光光度计。1.单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，一般用最大吸收波长进行比色。常用方法有2种。（1）标准曲线法：用标准液制作一系列标准管的标准曲线，样品测定结果查标准曲线求知。（2）对照管法：制作标准测定管和样品测定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰）处测定吸吸光度进行比较，可直接求出样品含量。如VB12含量测定：精确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀释n倍，使每含的标示量为30μg/ml，另外配VB12标准液浓度为30μg/ml，蒸馏水调零，用361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量（μg/ml）=（A样品/A标准品）×30；注射液中VB12含量（μg/ml）=（A样品/A标准品）×30×n（稀释倍数）÷V（取样量,ml）2.混合物中两物质同时测定（两物质的最大吸收峰有部分重合）例四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25

NNaOH中最大吸收峰为380nm，E1%1cm，λmax=372.0；在0.1NHCl中最大吸收峰为355nm，E1%1cm，λmax=303.2；两吸收峰都可以做为四环素的测定波长。但与金霉素共存时，因为金霉素在355nm处有吸收（金霉素在0.1NHCl中E1%1cm，λmax=182.6），只能用380nm测定四环素。混合样品在355nm处测定二者的总吸光度,在380nm处测得四环素的吸光度，则两者的浓度都可以求出。测定方法：(1)测定1%混合物在0.1NHCl溶液的吸光度A335(2)测定1%混合物在0.25NNaOH溶液的吸光度A380，计算：四环素浓度C1（g%）=[AC1380/E1%（C1）1cm，380]=AC1380/372.0金霉素浓度C2（g%）=[AC1+C2335－（E1%（C1）1cm，355×C1）]÷E1%（C2）1cm，355=[AC1+C2335－（303.2×AC1380÷372.0）]÷182.6四.紫外分光光度法的应用：紫外光度法广泛应用在化学、生物化学、医学、环境检测、食品卫生检验分析方面。凡在200-1000nm范围内有特征性吸收，或与试剂反应后形成特征性吸收,符合郎伯—比尔定律的，都可以分析，如：1.测定蛋白质：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸对280nm的紫外线有最大吸收，吸收值与其浓度成正比，样品不必反应，稀释后直接测定。2.肌红蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需要标准品，通过摩尔吸光系数法，可直接测定。3.还原性谷胱甘肽：与四氧嘧啶反应，生成物在305nm处有最大吸收峰。4.过氧化氢酶：有可见光测定法，也有紫外法。5.抗生素：大部分可用紫外法测定，如青霉素、链霉素、氯霉素、四环素、金霉素、新生霉素。6.VA用乙醚提取，溶在异丙醇中用328nm测定。VB1用246nm分析。VB2用267和444nm分析。VB6用291nm分析。VB11用254nm分析。VB12用278、361、550nm分析。VD用乙醚提取，纯化后溶在乙醇中用265nm测定。Vc在乙酸介质中与I2反应：C6H8O6+I2

乙酸溶液C6H6O6（脱氢Vc）+2HI；样品中加入Vc后与I2反应，减少了I2，也减少了I3－生成，在一定范围内Vc与I3－成反比，用350nm测定I3－的显色减弱，间接测定Vc浓度。7.许多药物要用紫外光谱测定，如咖啡因用272.6nm；巴比妥类（安眠药）用220～240nm测定；5种氯丙嗪类药（镇定药）全用249～307nm测定；安眠酮用235和503nm分析；安定（镇静药）用240和285nm分析。8.食品中硒与邻苯二胺反应，将络合物提取到甲苯中，反应物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色测定。第八章原子吸收分光光度法的原理由原子结构理论可知，一个原子可具有多种能态，其中最低的能态称为基态，其它较高的能态称为激发态。处于基态的原子称为基态原子。原子吸收分光光度法的原理是：使样品中化合态的元素吸收热能，化合物解离后让元素变为基态原子。基态原子的能量最低，最稳定，如果基态原子受外界能量激发，其最外层电子可能跃迁到不同的能级，达到不同的激发态。电子从基态跃迁到能量最低的激发态（第一激发态）时要吸收一定波长的谱线，这一谱线称为“共振吸收线”。E6.E5.E4.E3.E2.E1.最低激发态能级（第一激发态）EE0.基态

原子能量的吸收和发射较高激发态能级而当电子从激发态再跃迁回基态时，则辐射出相同波长的谱线，这一谱线称为“共振发射线”，两线均称为共振线，波长是相同的。由于各种元素原子结构和核外电子排列不同，因此从基态跃迁到第一激发态（或由第一激发态跃迁回基态）时吸收或辐射的能量不同，因而各元素有不同波长的共振线，所以元素的共振线又称为元素的特征谱线。因为从基态到第一激发态的跃迁最容易发生，所以