血红蛋白的提取和分离

㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：一基础知识㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：2、概念：一基础知识㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶又叫分子筛）2、概念：

根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶分子筛作用，来进行分离。一基础知识凝胶色谱法分离蛋白质的原理1、概念：

在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：1、概念：

在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：2、作用：能够抵制对溶液的的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。1－2㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团

在一定的PH下，这些基团会带上一定的PH。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分类：聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵）和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分类：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。SDS

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。SDS单条肽链的分子量

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。SDS单条肽链的分子量分子的大小测定（）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定（）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？二实验操作用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定二实验操作血液有哪些成分？血液血

浆水分其他

物质血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血

细胞白细胞血小板红细胞(最多)血红蛋白(90％)两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液有哪些成分？血红蛋白每个肽链环绕()，此基团可携带()。血红蛋白因含有()而呈红色。每个肽链环绕()，此基团可携带()。血红蛋白因含有()而呈红色。一个亚铁血红素基团每个肽链环绕()，此基团可携带()。血红蛋白因含有()而呈红色。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳每个肽链环绕()，此基团可携带()。血红蛋白因含有()而呈红色。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色五倍体积①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入

用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色五倍体积生理盐水

重复洗涤()次，直至上清液中已没有()，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

重复洗涤()次，直至上清液中已没有()，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三

重复洗涤()次，直至上清液中已没有()，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三黄色初次离心后的结果3次洗涤后的结果

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放蒸馏水

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放原血液蒸馏水

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放原血液甲苯蒸馏水

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:(3)分离血红蛋白溶液有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物分离血红蛋白溶液取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。(4)透析取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。(4)透析1取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。透析袋(4)透析1取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。透析袋磷酸缓冲液(4)透析1取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。透析袋磷酸缓冲液7.0(4)透析1取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0(4)透析1取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液(4)透析1利用透析袋透析2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的()，在0.5ml的()头部切下()长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的()，在0.5ml的()头部切下()长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的()，在0.5ml的()头部切下()长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的()，在0.5ml的()头部切下()长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。注意c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面100目c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面100目上部c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面100目上部出口部位c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龙管c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龙管打开与关闭c.剪尼龙网小圆片覆盖在()上，用()的尼龙纱将橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色谱柱下端用移液头部做()，连接一细的()，并用螺旋夹控制尼龙管的()，另一端放入收集()的

收集器内。橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龙管打开与关闭色谱流出液⑤安装其他附属结构。③顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装：

将上述三者按相应位置组装成一个整体。2）凝胶色谱柱填料的处理(1)凝胶的选择：

()(G-75)

“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。

75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。2）凝胶色谱柱填料的处理(1)凝胶的选择：

()(G-75)

“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。

75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。交联葡聚糖凝胶（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于()中充分溶胀后，配成()。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于()中充分溶胀后，配成()。蒸馏水（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于()中充分溶胀后，配成()。蒸馏水凝胶悬浮液①固定：将色谱柱垂直固定在支架上②装填：将()一次性的缓慢倒入(

)内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法①固定：将色谱柱垂直固定在支架上②装填：将()一次性的缓慢倒入(

)内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液①固定：将色谱柱垂直固定在支架上②装填：将()一次性的缓慢倒入(

)内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液色谱柱凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。注意③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在(

)高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分()12小时。③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在(

)高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分()12小时。50cm③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在(

)高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分()12小时。洗涤平衡50cm在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？思考在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。思考液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。注意装配好的凝胶柱你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？思考

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？思考3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的()缓慢下降到与()平齐，关闭出口。50cm高3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的()缓慢下降到与()平齐，关闭出口。缓冲液50cm高3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的()缓慢下降到与()平齐，关闭出口。缓冲液凝胶面50cm高②加透析样品①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用()将1ml()的样品加到色谱柱的()③样品渗入凝胶床：()④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待()接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每()收集一试管连续收集①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用()将1ml()的样品加到色谱柱的()③样品渗入凝胶床：()④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待()接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每()收集一试管连续收集吸管①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用()将1ml()的样品加到色谱柱的()③样品渗入凝胶床：()④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待()接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每()收集一试管连续收集吸管透析液①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用()将1ml()的样品加到色谱柱的()③样品渗入凝胶床：()④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待()接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每()收集一试管连续收集吸管透析液顶端①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用()将1ml()的样品加到色谱柱的()③样品渗入凝胶床：()④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待()接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每()收集一试管连续收集吸管透析液顶端样品完全进凝胶层①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用()将1ml()的样品加到色谱柱的()③样品渗入凝胶床：()④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待(