应用外周血母血中的胎儿淋巴细胞诊断产前诊断

应用外周血母血中的胎儿淋巴细胞诊断产前诊断

目前，有几种方法可以在产后诊断遗传疾病。常规使用有:羊膜腔穿刺、绒毛细胞吸取术、胎儿脐带血穿刺等。这些方法诊断的准确性很高,但均属有创性操作,有致胎儿流产的风险,故主要用在怀疑孕育有染色体异常胎儿和高龄孕妇中。许多学者致力于研究适用于低风险大群体孕妇筛选的无创性产前诊断技术。利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断是近年研究较活跃,颇具潜力的无创性诊断方法之一,临床上也得到一定程度的应用。在复习了相关文献后,对这方面进展综述如下。一、胎儿红细胞的分离目前已经确定的存在于母血中的胎儿细胞主要包括3种:滋养叶细胞、淋巴细胞、有核红细胞。1.滋养叶细胞是最早被证实存在于母血中的细胞,因其形态大理论上易于分离,但母体能迅速清除进入其肺循环中的滋养叶细胞而使其在外周血中含量很少,且缺少特异性单抗,再者其多核特点及其与胎盘的嵌合现象,将其用于产前诊断有可能误诊,不是理想的诊断细胞。2.淋巴细胞的研究相对较迟,Walknowska等在1969年发现在孕有男性胎儿的母血中的淋巴细胞分裂原存在Y染色体。1979年Herzenberg等报道利用抗HLA-A2抗原的单抗及FACS技术,从孕妇外周血中分离出胎儿淋巴细胞。后来也有不少研究报道。但胎儿淋巴细胞产生于孕中期;且与母体淋巴细胞表面抗原不易区分,难制备出特异性抗体,分离较难;另外胎儿淋巴细胞在孕妇血中生存时间较长,其至可长达27年之久,诊断结果可能不能反映当次妊娠而误诊。因而淋巴细胞也不是理想的诊断材料。3.胎儿NRBC目前认为是用于产前诊断的最佳细胞。其原因如下:NRBC含有细胞核基因的全部成分;在孕早期(头3个月)胎儿血中的含量较丰富,理论上讲红细胞更容易自母血中分离出来;胎儿NRBC在外周血中的寿命有限,在产后母血中基本不会滞留,产前诊断不受既往妊娠的胎儿NRBC的影响;另其表达几种特异的抗原如CD71受体,CD36受体,GPA受体和特异的胎儿血红蛋白肽链如gama链等,作为细胞标记而利于细胞的分类,鉴定和富集。故胎儿NR-BC应用于产前诊断相对较准确。二、孕母外周血中胎儿的nrbc胎儿细胞在母血中的数量很少,且存在个体差异,出现的频率范围在1∶105-1∶109。Price等研究发现在20ml孕母外周血中约有200-2000个胎儿NRBC。Pmar-Bayrak-Toydemir等用单纯密度梯度后,Y染色体探针的二次荧光原位杂交(FISH)发现在正常怀男性胎儿的孕妇血中胎儿细胞的平均含量为1∶1.993。而怀非整倍体时为1∶994。很多研究发现,在胎儿细胞有遗传学异常时,母血中胎儿细胞出现的比率增多,这对产前遗传学诊断是十分有利的。三、y特异性dna的检测利用母外周血中胎儿细胞进行产前诊断,孕期何时采取血是研究者所关注的问题。Thomas等采用PCR技术研究用IVF方法怀孕男胎的妇女研究中发现Y特异性DNA早在孕33d和40d即可以在母外周血中被检测出来。PAO-LINKUO等采用三重密度梯度离心分离胎儿NRBC,发现NRBC的数目在整个妊娠期逐渐增加,在产后迅速下降,最多在分娩后3个月就不能测出。马旭等对19例妊娠男性胎儿孕妇外周血ZFY进行检测,探讨采集胎儿细胞行产前诊断的最佳时间,发现应在妊娠14w,同时提示胎儿细胞最早进入母血循环中的时间在不同个体间存在明显的差异。四、妊娠的中小型细胞1996年,经产妇作为嵌合体观点逐渐被接受。一项研究,使用定量PCR的技术,对40例曾经历过选择性妊娠终止的妇女外周血样本分析,结果显示大约500000有核胎儿细胞存在于这些在怀孕头三个月就终止妊娠妇女体内。因此,经历两三个月这么短时间的妊娠就足够使该怀孕妇女成为嵌合体。随后又作了一些关于胎儿细胞微嵌合现象与自身免疫性疾病关联的研究。由于存在“胎儿细胞微嵌合现象”,有人认为母血中胎儿细胞的持续存在可能是无创性产前诊断潜在错误诊断的来源。但产后持续存在的细胞是淋巴细胞或是脊髓母细胞,而目前用于产前诊断的最主要细胞是胎儿NRBC,故使得产前诊断受既往妊娠的胎儿细胞的影响比较小。五、抗3g-pa-荧光激活细胞分离和细胞内分离常用的分离富集胎儿细胞的方法有密度梯度离心,荧光激活细胞分离法(FACS)、磁激活细胞分类法(MACS)、电荷流式分类(CFS)、选择性细胞培养技术、单细胞显微操作分离法等。单纯密度梯度离心获得胎儿NRBC数量少,纯度低,因而一般作为分离富集的第一步而和其它方法相结合。Bianchi等应用针对胎儿红细胞抗原即CD71,CD36,GPA等三种不同的单抗进行荧光激活细胞流式分类,结果发现用CD71或CD36检出胎儿性别的精确度分别为57%和88%,而用抗GPA分离的细胞预报的胎儿性别的正确率为100%。在富集和分离过程中,选择特异性抗体来标记胎儿细胞是分离的关键。Wachter用电荷流式分类法对16例孕妇(怀男婴13,Downs综合征2例,18三体死婴1例)外周血进行初步分离,发现每20ml血样中平均有2000个胎儿细胞,都由染色体的FISH证实。BTutschek等对12例健康孕妇外周血通过体外胎儿造血细胞的克隆性培养,后经过对单一克隆显微操作和荧光PCR,获取纯的胎儿克隆的研究,发现通过该方法能获得大量的胎儿细胞。六、抗b为胎儿骨髓炎仪检测所产生的y染色体胎儿细胞经过分离,富集后数量仍少,但PCR和FISH技术的不断发展,从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断在临床上已得到一定程度的应用。目前主要利用PCR技术对胎儿单基因病和FISH技术对胎儿染色体异常进行诊断。分离的胎儿细胞主要用于性别的测定,胎儿Rh基因的测定,胎儿非整倍体检测及一些单基因遗传病的诊断(如β地中海贫血)。当前最有诊断意义的当属Rh阴性孕妇的胎儿Rh基因的测定,这可以防止Rh血型不合性溶血症。其次是胎儿性别的鉴定,因母体不含Y染色体,所以胎儿细胞不纯对此无明显影响。有研究者们直接用Y染色体特异性DNA探针分析母血中的有核细胞,16例生男孩的孕妇血样中显示有Y特异性杂交信号的12例,4例生男孩的孕妇血样中无此特异性信号。其中假阴性和假阳性例子并不少见。假阴性的原因可能是待测DNA序列的拷贝数少,样品内靶序列量太少,从而无法检测出某特定序列;假阳性的原因可能是外源性DNA污染。因此,必须设计合适的母血中胎儿有核红细胞DNA的引物及适宜的扩增条件,以提高检测的灵敏度及特异性。另外就是胎儿非整倍体的检测,有不少学者将FISH技术与这种无创性产前诊断相结合,成功地诊断了多种染色体病。已诊断出非整倍体有:21三倍体,18三倍体,13三倍体,47,XYY核型,47,XXY核型等。Simpson采用抗CD71和CPA的单抗标记和流式细胞仪分离FNRBC,以X、Y、18、21号染色体专一性探针作FISH,8例非整倍体胎儿只有1例未被检出,无1例假阳性。Faridenz等应用五色荧光原位杂交,通过细胞标记X、Y、13、18、21号染色体,准确识别非整倍体妊娠。对于单基因病,由于混杂细胞的影响,应用受到一定的限制,只有在胎儿病变基因来自父方,且母亲不带有该病变基因时才能进行诊断。七、低风险孕产妇群体探针的应用利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断的研究已取得很大的进展,在临床上也有一定的应用价值。该技术改变以往产前诊断的方式,适于低风