无创产前基因检测联合血清学产前筛查在产前诊断胎儿染色体非整倍体中的应用

无创产前基因检测联合血清学产前筛查在产前诊断胎儿染色体非整倍体中的应用

中国是一个出生缺陷严重的国家。每年新增出生缺陷120万，每年约占人口的4.6%。21号和13号染色体综合征是人类最常见的三种染色体疾病。孩子的脸很特殊。大多数儿童患有严重的精神障碍和器官畸形，这对家庭和社会有重大影响和负担。现代医学对胎儿染色体疾病尚无有效的治疗方法,最好的方法是在孕期通过产前筛查及诊断,发现异常并及时采取相应措施。但是临床常用的产前筛查方法存在较高的假阳性率和漏检率,而介入产前诊断虽准确率高,却可能导致胎儿宫内感染和流产,难以被广大孕妇和家庭所接受。随着高通量测序技术的发展,无创产前基因诊断应运而生。本研究通过对792例血清学筛查高危孕妇,采用无创产前基因检测的方法进一步筛查,显著降低了假阳性率和漏检率。现将结果报道如下。1对象和方法1.1血清学筛查结果2013年5月-2013年12月,我院对14098例孕妇进行了血清学筛查,结果为21-三体和(或)18-三体的单胎孕妇有792例,孕周均在12-26w,知情同意后,全部进行无创产前基因检测。1.2方法1.2.1互通日期筛查孕妇清晨空腹时采集静脉血3ml,使用一次性无抗凝剂真空采血管,8小时内尽快处理分离血清,血清在4℃下可保存一周,-20℃下可保存一个月。采用时间分辨荧光检测法,确定孕妇的出生年月、孕周(14-21w)、体重、民族、既往病史等参数,将其输入筛查检测软件,进行产前筛查。本实验室21-三体筛查风险切割值(cut-off值)为1/270,筛查风险≥1/270判断为21-三体筛查高风险,18-三体综合征风险切割值为1/350,筛查风险≥1/350,判断为18-三体综合征高风险,反之判断为18-三体综合征低风险。1.2.2离心血浆分离无创产前基因检测主要包括血浆分离、DNA提取、文库构建、cBot成簇反应、测序及数据分析等过程。知情同意后,采用EDTA-K2抗凝管抽取孕妇外周血5ml,4℃冰箱保存,并于8小时内进行血浆分离,4℃以1600g离心10min,将上清液分装到2个2ml离心管中,4℃以16000g再次离心10min,所得上清液转入4个新的已编号的2ml离心管中,每个离心管转入600μl血浆,血浆样本总量不少于2ml,同时贴上相应的条形码。分离后的血浆在-20℃冰箱中可保存3天,长期保存需存放于-80℃冰箱。采用TIANampMicroDNAKit提取血浆DNA,以BGI-ShenzhenNIFTYLibraryConstructionKit试剂盒进行文库构建,cBot成簇反应后,采用Illumina公司的Hiseq2000测序仪进行全基因组测序,利用BGI-ShenzhenNIFTY软件进行数据分析,计算胎儿患病风险。1.2.3核分析中的染色体类型无创高危孕妇采用B超介导下经腹穿刺术获得绒毛、羊水或脐血等标本,通过细胞培养G显带染色体核型分析,进行产前诊断。2险孕产妇染色体核型的发现792例生化血清学筛查高危的孕妇进行无创产前基因诊断,检出高风险14例,高危检出率为1.77%,其中6例21-三体,3例18-三体,5例性染色体异常。14例高风险孕妇通过穿刺取样进行染色体核型确诊,结果显示,5例确诊为21-三体,另外1例21-三体孕妇因孕妇胎盘前置,产前介入诊断禁忌,时孕周28周,孕妇坚持足月分娩,采集出生后婴儿外周血进行核型分析,确诊为21-三体;3例18-三体均经核型确诊。因此,无创产前基因诊断对21-三体及18-三体的检测准确率为100%。但5例性染色体异常只有1例确诊为47,XXY,与无创产前结果一致,其余4例的核型结果显示无结构及数目异常。对778例无创检测阴性的孕妇进行随访,目前未发现染色体非整倍体异常的患儿。3无创产前基因检测技术目前染色体病尚无有效治疗方法,唯一有效的措施为广泛开展产前筛查与诊断,传统的临床筛查是通过血清学生化筛查,而目前通用母体血清学筛查由于缺乏中国孕妇人群各项筛查指标的正常值范围,从而无法确定产前筛查的高危切割值。另外,母体血清产前筛查各指标的检测方法中,酶免法(ELISA)最为常用,但采用该法进行定量检测时,易受很多因素影响,结果变异较大,导致各个医疗单位所采用的诊断指标差异很大,其灵敏性和特异性欠佳,假阳性率较高,严重影响了国内中孕期产前筛查的准确率。目前,传统的产前基因诊断方法虽然为产前诊断的金标准,但该方法主要通过绒毛活检、羊膜腔及脐静脉穿刺术获取胎儿遗传物质,对于孕妇及胎儿均具有一定的创伤,容易导致宫内感染,同时可导致0.5%~3%的流产率。1997年,Lo等在孕妇外周血中发现有胎儿游离DNA,为无创产前基因诊断技术的开展提供了理论依据。高通量测序技术的兴起,使无创产前基因诊断技术由理论变成了现实。而且胎儿游离DNA在分娩后短时间内将消失,平均半衰期为16.3min,2h后就无法检出,因此,该技术对再次妊娠时的检测结果没有任何影响。2010年,Lun等运用大规模并行基因组测序法成功检测出1例易位型21-三体。2011年,Chiu等应用无创产前基因检测753例21-三体高风险的孕妇外周血,其中86例胎儿为21-三体高风险,与染色体核型进行比较分析,发现21-三体胎儿的检出率为100%。本研究对792例生化血清学高危孕妇外周血进行无创产前基因组测序检测,检出6例21-三体综合征,3例18-三体综合征,检出率均为100%。但性染色体检测稳定性欠佳,有研究认为是由于GC含量的干扰所致,JiangF等以标准Z-Score值为基础,通过改进染色体内标参照及计算方式,一定程度上降低了GC含量的影响,实现结果值变异系数小,提高和稳定了18,13-三体及性染色体检出率。因此采用无创产前基因检测技术进行胎儿染色体异常筛查,符合临床检测要求,具有临床实际应用价值。相较于血清学筛查,无创产前基因检测技术覆盖面广(血清学筛查无法检测13号染色体及性染色体变异),同时还具有准确性高、无创等优点,尤其适用于试管婴儿。此外,该技术还拥有良好的可扩展性,除染色体非整倍体外,将来还可能应用于胎儿染色体微缺失和微重复、单基因病、甚至全基因组的检测。随着全基因组测序技术的不断进步和测序成本的不断下降,基于全基因组测序的检测技术拥有非常广阔的发展空间,将向更加快速化、早期化和个性化迈进。本研究采用无创产前基