视网膜新生血管动物模型的制备

视网膜新生血管动物模型的制备

成熟的视网膜血管会导致认知丧失和视觉丧失。视网膜新生血管(retinalneovascularization,RNV)多见于糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血性视网膜静脉栓塞,病因复杂,发病机制尚未十分明确。我们采用高浓度氧诱导方法建立小鼠的RNV模型,并观察其生长过程中形态学变化及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表达情况。1材料和方法1.1动物出生7d的C57BL/6N小鼠,雌雄兼有,与哺乳母鼠共同饲养,系清洁动物,由上海市第一人民医院动物房提供。1.2气孔接氧试验出生7d的C57BL/6N小鼠56只,雌雄兼有,一组28只放入一端位进气孔,另一端为出气孔的密闭容器内,进气孔通以流量为1.5L·min-1氧气,出气孔接氧浓度测量仪,每天测量氧浓度5次,控制室温23℃±2℃,容器保持氧浓度75%±2%,日光照明,5d后返回空气环境;另一组28只置于23℃±2℃空气环境中饲养作为对照。1.3动物分组、处理随机于出生后高氧组和空气组小鼠12d4只,14d4只,17d8只,21d4只,22d4只,25d4只,采用腹腔内注射过量3g·L-1戊巴比妥钠方法处死动物,摘除眼球。1眼作视网膜铺片,另1眼作石蜡包埋。1.4样品处理1.4.1trus顺丁烯二酸缓冲液的配制眼球取出后,置入4℃的4g·L-1多聚甲醛中固定10min,去除角膜、晶状体、虹膜,放射状剪开眼球壁,去除巩膜及脉络膜,取出视网膜再放入固定液中固定24h,ADP酶染色:用4℃50mmol·L-1的pH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液漂洗15min5次,之后加入37℃新鲜配置的0.2mmol·L-1的pH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液(其中含3.0mmol·L-1硝酸铅,6.0mmol·L-1氯化镁,ADP1g·L-1)10min,再用室温50mmol·L-1的pH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液漂洗15min5次,然后加入1∶10稀释的硫化铵,视网膜血管壁形成深棕色沉淀,最后用室温50mmol·L-1的pH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液漂洗15min3次,视网膜铺片,1∶1甘油PBS封片。1.4.2政生片的he染色眼球摘除后固定、脱水、石蜡液浸蜡。眼球作平行于角膜至视盘的矢状位的4μm厚度连续切片,任意选取不包括视盘的20张切片HE染色;任意选取另外3张切片作免疫组化染色。1.5结果决定了nihmage(ScionImage)软件包计算全视网膜面积、视网膜无血管区面积;统计分析应用SPSS10.0软件包作t检验和χ2检验。2结果2.1显著性对比t测量无血管区面积,空气组平均值为1.4962mm2,氧气组平均值为4.3050mm2,二者差异具有显著性(t=10.406,P<0.001)。无血管区面积与视网膜面积比值:空气组平均值为0.101631,氧气组平均值为0.297236,二者差异具有显著性(t=10.643,P<0.001)。2.2.穿过视网膜内界膜细胞核计数(每个标本取20张切片计数,并取其平均数)。可见空气组穿过视网膜内界膜细胞核数为每片5.75个±3.77个,而氧气组每片为104.38个±28.72个,统计有显著性差异(t=9.630,P<0.001)。2.3血清中企业大鼠血清中12d阴性的变化免疫组化染色切片观察位于内丛状层和内核层毛细血管,内皮细胞胞浆有无棕色染色颗料。氧气组12d阴性,14d开始有部分呈阳性(4个标本中有1个),17d大部分呈阳性(8个标本中有7个),21d减少(4个标本中1个),22d及以后为阴性。空气组免疫组化仅14、17、21d各有1个标本呈阳性。3讨论3.1小鼠视网膜新生血管的情况用于研究新生血管形成机制及抗新生血管生成药物的研究的视网膜新生血管的动物模型有多种。有高氧诱导动物如大鼠、小鼠、犬、猫致血管增生性视网膜病变模型。此外,还有采用电凝、光凝等方法造成动物视网膜静脉阻塞,致视网膜、视盘、虹膜新生血管模型;激光破坏Bruch致脉络膜新生血管模型;转基因小鼠眼内新生血管模型等等。高氧致小鼠新生血管模型发生率为100%,因此成为应用最广的模型。本试验结果显示给氧组视网膜新生血管的发生率与以往的研究结果一致,表明本实验的动物模型诱发成功。正常的小鼠视网膜血管的发展在出生后2周。对出生0～7d的小鼠玻璃体动脉消退及视网膜血管形成的观察显示,出生时,玻璃体动脉依然很发达,随着正常发育的视网膜血管的增加而减少。生后第7天小鼠的视网膜血管发育,达到最大的玻璃体血管消退和最大的视网膜血管发育不完全的平衡,而刚出生的小鼠高氧环境下,玻璃体动脉异常扩张伴乳头新生血管,使模型的量化和重复性减低。另外,用80%及以上浓度氧气视网膜新生血管仅有轻微增加但死亡率却有较高的增加。该模型17～21d尤其是17d,视网膜新生血管最明显,之后新生血管逐渐被正常的血管分支方式所取代。所以,一般选用生后第7天的近交系C57BL/6J小鼠,75%高氧环境5d,继之以空气环境中饲养5d后观察视网膜新生血管的情况。当生后第7天小鼠在高氧环境中,视网膜血管最初的反应使血管的收缩继之以无灌注,较周边血管缺乏,近锯齿缘有较小的无灌注区。返回空气环境在14d之前,大的中央放射状血管扩张、扭曲。之后,在有血管与无血管交界处出现新生血管,最后退化、正常化。高氧诱导视网膜新生血管模型,左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有很好的一致性,这就为我们用1眼作血管形态学研究,另1眼作其他研究(如生长因子分析)提供了可能。3.2vegfmrna表达变化VEGF又称血管渗透因子,是一种碱性蛋白,正常状态下,VEGF分泌量较低,在缺氧或某些病理状态下,视网膜细胞的VEGFmRNA表达明显增加。眼部新生血管与VEGF有密切关系。临床研究发现,增生性糖尿病视网膜病变患者视网膜各层VEGFm-RNA表达明显上调。镰刀状贫血视网膜病变新生血管的滋养血管及视网膜前血管VEGF免疫反应性最强,主要反应产物位于血管内皮细胞。视网膜中央静脉阻塞伴青光眼患者视网膜内VEGFmRNA表达上调。非年龄相关性黄斑下新生血管膜患者玻璃体腔内VEGF水平上升。年龄相关性黄斑病变的黄斑部色素上皮细胞VEGFmRNA表达上调。在动物试验中发现,在高氧诱导动物模型中,在高氧情况鼠视网膜最内层VEGF表达下降,返回空气环境时表达上升,VEGF表达短暂,在血管即将形成达到高峰,而一旦血管形成后其表达迅速下降。在相对缺氧6h,视网膜VEGFmRNA出现高表达,12h达到高峰,之后有所下降,但VEGF水平仍高于正常对照组,并持续数天,随着新生血管的萎缩,VEGF水平下降至正常水平。本试验显示,本试验用免疫组化方法检测组织中VEGF的表达,从14d免疫组化呈阳性,持续至21d。3.3adp酶组织化学法检测视网膜血管分布对于人的视网膜、脉络膜的新生血管,可以用FFA、ICG来动态观察,对于老鼠这类小型动物用FFA来观察眼底血管改变较为困难。用视网膜铺片容易观察视网膜血管发育及新生血管的形态,能直接反映视网膜血管变化的形态及分布。并且通过计数新生血管、无血管区占据的钟点,进行计分量化,来评价视网膜血管疾病的病变程度。ADP酶组织化学法用于视网膜铺片则能显示视网膜血管的形态及分布,还可用于尸体眼检查,可选定一定的部位制作病理切片观察组织结构的改变,适宜大量制作,在暗处可保存数年。因此,本试验我们选用视网膜铺片ADP酶染色观察视网膜血管分布状态。在试验中,该方法可以显示视网膜大血管及周边小血管。空气组视网膜血管从视盘至周边部分布均匀,高氧组近视神经盘血管分枝少,周边部血管分布于空气组没有明显差异,但赤道部血管紊乱,血管纹理不清。视网膜内界膜在正常情况均匀一致而无特殊结构,无细胞。视网膜血管