几种dna分子标记技术的研究进展

几种dna分子标记技术的研究进展

遗传作为一种易于识别的遗传因子表现形式，在研究和育种植物资源方面发挥着非常重要的作用。目前,应用较为广泛的遗传标记有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。形态标记指植物的外部特征,细胞标记主要是染色体的核型和带型,生化标记主要包括同工酶和贮藏蛋白。这3种标记都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目有限,多态性较差,易受环境条件的影响。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异,是在DNA水平上遗传变异的直接反映。DNA分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测,数量极多,遍及整个基因组,多态性高,遗传稳定,不受环境及基因表达与否的限制。DNA分子标记从它诞生之日起,就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后,分子标记技术日趋成熟。现已出现的DNA分子标记技术有几十种,基本都是建立在RFLP、PCR和重复顺序的基础上的。下面就几种重要的DNA分子标记技术加以介绍。1rflp指纹探针所谓RFLP,是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,含同源序列的酶切片段在长度上的差异。20世纪70年代,限制性内切酶的发现使DNA变异研究成为可能,1974年RFLP作为遗传工具由Grodjicker创立,1980年由Botstein再次提出,并由Soller和Beckman(1983)最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定,这是第一个被应用于遗传研究的DNA分子标记技术。限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点,如果因碱基的突变、插入或缺失,或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生,用限制性内切酶消化基因组DNA后,将产生长短、种类、数目不同的限制性片段,这些片段经电泳分离后,在聚丙烯酰胺凝胶上呈现不同的带状分布,通过与克隆的DNA探针进行Sourthern杂交和放射自显影后,即可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP图谱。RFLP分析中所使用的探针通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。RFLP指纹图谱的优点主要表现在:第一,可靠性较高。因为它由限制性内切酶切割特定位点产生;第二,来源于自然变异。依据DNA上丰富的碱基变异不需任何诱变剂处理;第三,多样性。通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异,在数量上无任何限制;第四,共显性。RFLP能够区别杂合体与纯合体;第五,数量性。具有数量化。在80年代,随着PCR技术的出现与发展,PCR-RFLP技术应运而生,它提高了RFLP的分辨率,降低了技术难度,并且可用生物素标记探针代替放射性探针,避免污染。但是RFLP指纹技术也有其固有的缺陷,首先是操作烦琐,相对费时,其次是具有种属特异性,且只适应单/低拷贝基因,限制了其实际应用,最后它最主要的缺点是由于它的信息产生是因为碱基突变而导致的限制性酶切位点的丢失或获得,所以RFLP多态位点数仅1—2个,多态信息含量低,仅0.2左右。线粒体DNA的研究使RFLP的应用有了新的发展,由于mtDNA结构简单,分子量小(仅15.7-19.5),适合于RFLP分析,而且其不受选择压力的影响,进化速度快,适合于近缘物种及种内群体间的比较,另外,mtDNA属母性遗传,一个个体就代表一个母性群体,有利于群体分析,用有限的材料就能反映群体的遗传结构,因此,mtDNA-RFLP指纹技术用于遗传多样性的研究有其独到的优势。2染色体dna片段杂交是一种基于Southern杂交的分子标记技术。它利用特异性核酸片段作探针,直接同染色体DNA片段杂交,在染色体上显示特异DNA。可采用同位素标记探针,杂交后通过放射自显影显示杂交信号,也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。原位杂交的优点是准确、直观,但技术非常复杂。3循环一般情况下dna的检测即聚合酶链式反应。此项技术是模仿DNA在生物体内的自然复制过程,来扩增DNA片段。PCR的模板是DNA,依据被扩增区域两侧边界DNA序列人工合成一对引物(通常为20个碱基的单链脱氧核苷酸小片段),每种引物分别与对应的一条DNA链互补,在DNA聚合酶的作用下扩增DNA片段。PCR反应一般经三步完成一个循环:1.高温变性,使DNA双链解开,2.低温退火,让引物与单链模板互补结合,3.中温延伸,以互补的引物为复制起点,dNPTS为原料,进行复制。这样一次循环,DNA就扩增一倍。经25-30次循环后,DNA的量就达到足以检测的水平(ng级)。PCR的优点是不需要同位素,安全性好,便宜,快速易行,易于自动化。目前大多数分子标记技术都是建立在PCR技术的基础之上的。如近年出现的AS-PCR(AllelespecificPCR,等位特异PCR),MAAP(MultipleArbitaryAmpliconProfiling,多任意扩增子图谱),SCAR(Sequence-characterizedamplifiedregions,序列特征扩增区),DAF(DNAamplificationfingerprinting,DNA扩增指纹),STS(SequenceTaggedSite,测序的标记位点)等。4rapd技术RAPD技术是1990年发明并发展起来的。它以PCR技术为背景,以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物,对所研究的基因组DNA进行PCR扩增,产生多态性的RAPD片段,这些扩增片段的多态性反映了基因组相应区域的多态性。在基因组DNA中有丰富的反向重复序列,在真核生物中,几乎每2000bp有1-10个反向重复序列。由于随机引物较短,且在较低温度条件下退火,因而引物与基因组中反向重复序列结合机率大为提高。一般认为,RAPD的多态性是两个反向重复序列之间的序列差异。RAPD技术源于PCR技术,但又不同于PCR技术,差别主要体现在随机扩增引物上。首先,随机扩增引物是单个加入,而不是成对(正、反向引物)加入,其次,随机引物短,一般RAPD技术采用的引物含10个碱基,由于随机引物较短,与常规PCR相比,RAPD退火温度较低,一般为35-45℃。RAPD技术以一系列随机引物对基因组进行检测,因而能检测多个基因位点,覆盖率比较大,并且引物越多,覆盖面越广,遗传信息也随之增加,因此RAPD多态信息含量(PIC)值波动较大,在0.2-0.9之间,另外,RAPD指纹呈孟德尔式显性遗传。RAPD技术也有缺陷。首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂;其次,由于随机引物较短,因而对一些PCR因素更敏感,重复性较差,一般来说,对于特定的仪器设备,对其反应条件反复进行优化,可以得到较可靠的结果。RAPD技术操作快速、简便,不依赖基因组遗传信息,因此在遗传研究中被广泛使用。也有研究者用其它生物技术与RAPD技术结合,以发展其应用性,将代表遗传特异性的RAPD标记进行纯化、克隆和测序,然后根据此片段合成特殊位点引物,再用于PCR扩增。这种标记类型称作特征序列扩增区(Sepuence-CharacterizedAmplifiedRegions).5双酶切指纹aflp扩增片段长度多态技术(AFLP),又名限制片段选择扩增技术(SelectiveRestrictionFragmentAmplification,SRFA),于1993年由荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等发明,并已申请专利。AFLP指纹技术是在RFLP与RAPD两种指纹技术基础上建立和发展起来的,其操作流程主要有:首先用限制性内切酶将基因组DNA消化;其次,将人工双链DNA接头通过T4连接酶加在这些限制性片段两端,形成带有接头的特异片段;最后通过PCR引物与接头3端的特异性识别,进行特异的扩增。当基因组DNA由于突变而使限制性酶切位点发生改变,或引物特异识别位点发生突变,或两个限制性位点间发生缺失时都将产生多态的指纹谱带。用于AFLP分析的限制性酶一般为六碱基识别位点的内切酶(EcoRI,PstI,SacI)和四碱基识别位点的内切酶(如MseI,SeaI),为使酶切片段大小分布均匀,一般采用两种限制性内切酶进行双酶切,其中一个酶为多切点,另一个酶切割位点相对较少,如EcoRI与MseI搭配可产生三种类型:两端均为EcoRI酶切位点的片断、两端均为MseI酶切位点的片段、一端为EcoRI,一端为MseI酶切位点的片段,另外这种双酶切处理方式可使操作简化,不必在准备模板时对限制性片段进行选择性纯化,因为研究证明,带有六碱基内切酶位点的限制性片段比两端均为MseI酶切位点的片段更优先扩增,再就是这种处理方式增加了引物组合,从而可获取更多的多态信息。AFLP接头是双链寡核苷酸,只与限制性片段的突出单链连接。AFLP的引物由三部分组成:与接头互补的核心部分,与酶切位点互补的部分及3端的选择性碱基。引物有两大特点:以鸟苷酸(G)起头,这可防止产物自身二级结构化,另外引物的选择性碱基为1-3个,在次范围内,有很好的特异性效果,超出这一范围将易引起错配。AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD与RFLP优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关(r=0.501),而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关(r=0.826)。因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。目前,AFLP作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。不过也有研究认为,AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高,另外用于遗传作图时,少数的标记与图谱紧密度有出入。6第三代a光监管芯片-dna芯片snpDNA芯片技术是一种以杂交测序基本理论为基础的新型生物技术。它的产生背景是人类基因组序列日益明朗,迫切需要一种高效、准确的遗传分析系统来确定各个基因的功能,人类第一块DNA芯片于1996年诞生。DNA芯片是根据待测的基因片段,确定可以与之杂交的探针序列,将大量已知的探针固定于支持物上。根据探针来源,DNA芯片有两种:一种是采用显微光烛刻技术或压电打印技术在芯片特定位置原位合成寡核苷酸探针的芯片,另一种是将克隆基因或PCR扩增产物作为探针显微打印到芯片上的微集芯片。DNA芯片技术一般先提取基因组(DNA或RNA),然后用固相PCR系统对靶序列进行高效、特异的扩增,最后将扩增产物用荧光(或生物素、同位素)进行标记。靶基因准备好以后,让它与DNA芯片上探针序列进行杂交,这一操作在DNA芯片自动孵育装置中进行,由其自动控制时间、温度及反应缓冲液配比。一般进行基因表达监测实验时要求低温、时间长、盐浓度较高,用于突变检测实验时要求高温、时间短、盐浓度低,这一过程数十秒完成,杂交完毕,漂洗掉未杂交分子,然后在激光共聚焦荧光扫描显微镜下对DNA芯片表面的每个位点进行检测。DNA芯片一般用于测序、基因表达、疾病诊断,也可用于基因型及多态性检测。基因芯片单核苷酸多态性(SNP)标记物定位试验,可以检测单个碱基的变异,确定基因多态性,获得指纹图谱,绘制出更精确的第三代遗传图谱,用于连锁分析。DNA芯片技术作为一种新兴的生物技术,其高效高速性将给生命科学带来深远影响,但由于其尚处于发展阶段,因此其造价、探针的密度与纯度还有待完善。7小卫星与微卫星的共显性遗传Wyman等(1980)认为在人体基因组中含有高变区(HyperVariableRegions.HVRs),并证明这些高变区是一些串联重复序列,Jeffreys等(1985)发现重复序列中重复单位的核心序列是相似的。串联重复序列由两种类型组成,即小卫星DNA和微卫星DNA(SimpleSequenceRepeats,SSR)。小卫星DNA是一些重复单位在11-60bp,重复次数在成百以上,总长度由几百至几千个碱基组成的串联重复序列,主要分布于染色体近端粒区和着丝粒区,而微卫星是以1-6bp的短核苷酸序列为核心单位,长度小于100bp的小片段,它广泛随机地分布于真核生物基因组中,在DNA序列中,平均每6bp就可能出现一个。Winter等(1992)报道,除着丝粒及端粒区域外,微卫星广泛地分布于染色体几乎所有区域,在哺乳动物中,几乎每个基因都存在一个微卫星标记。小卫星与微卫星均遵循孟德尔共显性遗传方式。微卫星标记按其核心序列碱基数可分为单、二、三、四、五、六核苷酸微卫星,其中(AC/TG)n型微卫星最多,人类基因组DNA中,平均每30kb就可能出现(AC)n,绵羊平均为65kb。Weber等(1990)根据微卫星自身结构又将微卫星分为完全、不完全、复合微卫星,完全微卫星由不中断的重复单位串联而成,不完全微卫星是指重复单位间有3个以下的非重复碱基间隔,且两间隔间重复单位连续重复数不低于3,复合微卫星由几类串联重复单位构成,中间有3个以下碱基间隔,且两间隔间重复单位连续重复数不低于5。关于小卫星与微卫星的产生,多数学者认为是DNA复制或修复时,滑动链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失,因而在不同个体或不同种群间产生长度多态性。小卫星DNA一般与RFLP技术结合以获得小卫星DNA指纹图谱,即用小卫星DNA作探针进行Southern杂交。与RFLP相比,一个小卫星探针一次能检测到10-20个高度多态的位点,使多态信息含量(PIC)升至0.7-0.9之间,但小卫星DNA指纹的缺点限制了它的应用,一方面,技术上存在与RFLP技术一样的缺点,另一方面,它在染色体上分布不均匀,不利于连锁分析,再就是小卫星探针比较长,难以获取,而且数量有限。微卫星DNA既可用作探针获得指纹图谱,也可通过PCR方法进行微卫星位点多态性分析。Ali等(1986)人工合成简单重复序列(GATA)4,(GACA)4等作为探针,与人的基因组酶切片段进行Southern杂交,获得了具有个体特异性的DNA指纹图谱,龚炎长(1997)用(TG)10探针分析了六个猪品种的遗传变异关系,在羊的研究方面,用作微卫星的探针有(GTG)5、(GT)5、(CACA)4、R18.1、PGB725。研究发现微卫星由侧翼序列将核心序列特异地定位于染色体,该侧翼序列在物种间具有较高同源性,因此,可以根据微卫星两端的侧翼序列设计引物,进行PCR扩增以获得微卫星DNA指纹图谱。由于微卫星核心序列分布于结构基因侧翼或内含子中,因此,它承受的选择压力较小,在物种进化