植物基因组学研究的蛋白质组学技术

植物基因组学研究的蛋白质组学技术

近年来，通过对南角模型和水稻矩阵的模拟，植物基因组学研究转向功能基因组学。目前一些研究功能基因组学的新方法和实验技术体系如cDNA微阵列、DNA芯片、基因表达系统分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)和基因敲除(geneknockout)均能有效分析大量基因的表达和功能模式,并取得了很大进展。但是基因功能的实现最终是以蛋白质的形式体现的,而蛋白质有其自身特有的活动规律,在转录水平上所获取的基因表达信息并不足以揭示在细胞内的确切功能。因此,需要对蛋白质的表达模式和功能模式进行直接分析。在此背景下,蛋白质组学应运而生。蛋白质组学是后基因组学的一个重要组分,也是当前生物学领域研究的热点。近年来,高通量蛋白质组技术如双向电泳、质谱技术、蛋白质芯片技术和酵母双杂交体系的建立,加速了植物蛋白质组学的发展。目前植物蛋白质组学研究已由植物群体、组织和器官水平深入至亚细胞水平,一些重要的细胞器如叶绿体、线粒体等蛋白质组已被鉴定,并发现新的叶绿体和线粒体蛋白质。蛋白质组是指一个生物体基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。与基因组不同的是,蛋白质组作为一个整体,在不同的时空条件下,在一个生物体的不同组织中是不同的。而一个生物体仅有一个特定的基因组。一个生物体的蛋白组未必与基因组存在一一对应关系,主要是因基因存在转录后的不同剪接方式和翻译后蛋白的修饰所致。因此,蛋白质组研究是为了识别及鉴定一个细胞或组织所表达的全部蛋白质以及它们的表达模式。要研究生物体中“全部蛋白质”是一件非常困难的事情。目前生物学家提出了功能蛋白组学的概念,从局部着手,注重研究那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质全体。因此,从一个生物体的具有特定功能的器官、组织、细胞着手,在不同生理条件下研究表达蛋白质的功能。1蛋白质分离技术蛋白质分离技术、鉴定技术(如生物质谱技术)和支持质谱数据的蛋白匹配数据库是蛋白质组研究的3大关键技术。近年来,这些技术发展较快,尤其在生物质谱技术上快速改进加速了植物蛋白质组研究步伐。蛋白质分离技术主要包括双向电泳和液相色谱,有些蛋白芯片如:SELDI-TOF-MS也可用于蛋白质的分离和鉴定。蛋白质组研究的技术线路流程:蛋白样品→1D或2-D电泳→图像采集分析→在胶上切下感兴趣的蛋白点,用Trypsin等消化→提取肽混合物→MALDI-TOF-MS质谱技术分析,获得肽质量指纹(PMF)→在Mascot等数据库中进行蛋白质匹配,鉴定蛋白质→获得阳性鉴定蛋白质或未获得阳性鉴定蛋白质→纳升电喷雾串联质谱(nano-ESI-MS/MS)技术分析→蛋白序列标签(sequencetags)→数据库查询(EST或基因组)1.1与ipgs胶注的复合胶1975年,意大利生化学家O’FarrellPH等发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白质分离的分辨率而得以广泛应用,至今已经历了整整31年的发展,双向电泳技术已较为成熟,但在基本技术上仍未改变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、等电聚焦、SDS电泳等,主要技术线路流程:蛋白样品制备→干胶条水合→等电聚焦→聚焦后胶条平衡→SDS电泳→凝胶染色→图像扫描。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。最早采用等电聚焦的凝胶是用载体两性电解质与聚丙烯酰胺凝胶配制成pH梯度的管状胶。在每次电泳前需现制。由于实验条件和操作上的误差,往往会造成不同批次凝胶内部pH梯度不稳定和重复性差。而且在等电聚焦过程中因聚焦时间过长也会引起凝胶内部pH梯度的变化。目前使用的固相化pH梯度(immoblizedpHgradients,IPGs)干胶条弥补了上述管状胶的不足。IPGs干胶pH梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶共价结合形成的,随着凝胶聚合而将pH梯度固定。即使胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦,仍保持稳定的pH梯度。这是高分辨分离所必需的。IPGs胶灌注在塑料片上,然后盖上相同大小的塑料片,机械切割成固定大小而易操作的干胶条。目前伯乐公司(Bio-Rad)和通用保健集团下属的安玛西亚(AmershamPharmacia)均销售不同pH梯度和不同长度的IPGs干胶条。第二相电泳分离的重现性有明显提高,主要是因为使用了预制的SDS胶和灌制多板胶的设备,实现了实验系统的标准化,便于实验室内部及实验室之间数据比较和合作。在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制备的药剂必须与等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)兼容。通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质,然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型或两性去污剂以破坏疏水交互作用。CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulphonate)、TritonX-100和新的去污剂线性磺基三甲胺乙内酯(sulphobetaine)如SB3-10和ASB-14(amidosulfobetaine)是与IEF兼容的常用去污剂。还原剂二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和三正丁基膦(tributylphosphine,TBP)还原二硫键成巯基。在裂解液中只使用其中之一。DTT试剂带有电荷,因此在IEF过程中会迁移到胶外,引起样品蛋白质重氧化使得电泳过程中蛋白质的溶解性丧失。用不带电荷的还原剂如三正丁基膦取代DTT可以大大增强IEF过程中蛋白质的溶解能力,提高了蛋白从一维到二维转移效率。最早应用的裂解液配方:9.5mol/L尿素、4%(m/V)NP-40、1%(m/V)DTT、2%(m/V)合成载体两性电解质SCA(syntheticcarrierampholytes)。该配方适用于许多类型的蛋白样品,但并不是一种万能的方法,其中对膜蛋白溶解性较差。两性去污剂CHAPS可以有效溶解膜蛋白,特别是在浓度4%(m/V)CHAPS与2mol/L硫脲和8mol/L尿素混和物共用时溶解性最佳。硫脲是一种强变性剂,变性能力强于尿素,但其水溶性差,不能单独使用,但在高浓度尿素溶液中有较好的可溶性,因此尿素与硫脲混合物提高了溶解样品的能力。目前较好的裂解液常包含8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%(m/V)CHAPS、2mmol/LTBP和0.2%两性电解质。SB3-10和ASB-14也是有效的膜蛋白溶解剂,但其与高浓度的尿素不兼容,因此,用低浓度1%(m/V)SB3-10、1%(m/V)ASB-14与5mol/L尿素、2mol/L硫脲、2mmol/LTBP、0.2%两性电解质共用时可以有效克服上述困难,提高溶解性,这可能是目前最好的裂解液。阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)能破坏大多数非共价蛋白质相互作用,对膜蛋白的溶解非常有效,但与IEF不兼容。SDS可用于初始样品制备的溶解过程,首先将样品用1%(m/V)SDS溶解,然后用常用的裂解液稀释,目的是为了用非离子或两性去污剂将SDS从蛋白质中置换出来,从而使蛋白质保持在溶解状态。为了有效地溶解样品,并减少SDS在IEF中的负作用,必须控制蛋白质与非离子或两性去污剂比例(1:3)及SDS与非离子或两性去污剂的比例(1:8)。核酸会干扰IEF时蛋白质的有效分离,因为它能增加样品溶液的粘度且在某种情况下可以与样品蛋白质形成复合物,进而引起假象迁移和条纹的出现。处理核酸常用方法是在IEF前在蛋白样品溶解液中加入不含蛋白酶的内切核酸酶。一般用非专一性核酸酶或RNase和DNase混合物加入到提取液中可以高效降解核酸,以取得更好的IEF效果。利用SCA和核酸结合成复合物的能力通过超速离心来去除复合物。此外,利用超声波处理样品溶液,可以将核酸分子打成小片断,从而降低蛋白样品的粘度。高盐会干扰IEF时蛋白质的分离,因为盐能提高样品溶液的电导率,并引起高耗用电流,从而需化更长的时间到达高电压,延长了聚焦时间。因此,最好在IEF前除盐。目前一般用透析或液相色谱脱盐,样品可以通过冻干、聚乙二醇透析或用三氯乙酸(trichloroacteicacid,TCA)/丙酮沉淀的方法进行浓缩。TCA/丙酮沉淀可以引起蛋白酶的失活进而减少蛋白质的降解,同时可以去除干扰化合物,富集碱性蛋白质,如从全细胞裂解液中富集核糖体蛋白。样品溶液中的多糖不常对IEF有严重的干扰,因此通常不被考虑,主要是因为没有简单的处理方法。分离脂类的最佳方法是用有机溶剂沉淀样品中蛋白,而脂类物质溶解在有机溶剂中,通过离心,弃上清收集沉淀,从而达到分离的目的。对于沉淀后难溶的蛋白样品,不适用上述方法。对于大多数植物样品,采用有机溶剂丙酮沉淀植物粗蛋白样品。在蛋白样品裂解时,除了蛋白质降解外,最明显的假点蛋白修饰是氨甲酰化,这是因样品溶液中尿素降解所致。尿素在溶液中降解成氰酸盐,它可以与蛋白质的氨基反应,减少了蛋白的正电荷而使蛋白更酸性。因此在双向电泳中应使用新鲜的尿素溶液。在IEF期间,要控制温度在20℃～30℃左右以减少尿素的降解,因此,一些聚焦仪的制造商为确保在IEF期间恒定的运行温度,将每根IPG胶条的默认限制电流设置为50微安,以减少蛋白质的氨甲酰化。胶条水合按Bio-Rad公司的操作说明进行。首先,要选好IPGs干胶条的pH梯度。对一个新样品,最先使用宽范围、线性pH3.5～10梯度。但对大多数样品,这样做可能会降低pH4～7区域的分辨率,因为许多蛋白质的pI值分布在该区域。利用非线性的pH3.5～10IPGs干胶条在一定程度上缓解了这个问题。非线性pH3.5～10的胶条在pH4～7区域的梯度比pH7～10更为平坦,保证在大部分碱性蛋白质都能得到分辨的前提下,pH4～7区域能得到更好的分离。若用pH4～7的IPGs胶条则能在该范围得到更好的分离效果。等电聚焦在样品裂解液中运行。IPGs干胶条使用前必须在样品溶液中水合。水合期间,蛋白样品进入IPGs胶条,并分布于整个聚焦介质中,该技术实用且易操作。IPGs干胶条具有较高的蛋白运载能力。对于一根长度17cm的干胶条,最大运载量可以达到3毫克。干胶条水合可以采用被动水合或主动水合两种,在主动水合时,在胶条两端加上50V的低电压,使大分子量的蛋白质能充分进入IPGs胶条。在某些情况下,用杯上样(是指特殊设计的杯运载样品入水合后的IPGs胶条)的聚焦效果要优于胶条水合运载方法,特别在极端pH范围如pH3～6或pH7～10下,杯上样的效果更好。为取得最佳效果,杯上样应在碱性范围IPGs胶条的阳极或在酸性范围IPGs胶条的阴极上。此外,要注意在胶条水合开始时在胶背上应覆盖矿物油,以防止胶条水合或随后的IEF过程中水分散失。胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPGs胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否充分的指标。根据胶条长度不同,所需的伏特小时数不同,一般随着胶条加长而增加。伏特小时数范围从7cm胶条的10kV到24cm胶条的60kV以上。最佳聚焦时间即IEF分离达到稳定态所需时间,是获得最好图谱质量和重复性的基础。若聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹。但是过度聚焦会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出(电渗),引起蛋白图谱变形,以及在胶条碱性端产生水平条纹和蛋白质的丢失。因此,最佳聚焦时间必须根据不同蛋白质样品、蛋白质上样量和所用特定pH范围及胶条长度来确定。聚焦完成后,胶条既可以在中间电压500～1000V下短时间保持,便于随时进行第二相的平衡,也可以置于-80℃冰箱中进行长期保存。在第二相SDS分离前,必须要平衡IEF胶。主要目的是用含有SDS的第二相介质置换含有尿素的第一相介质,使分离蛋白质与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还原状态,避免发生重氧化,确保在SDS过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平衡过程而直接进入第二相的SDS分离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二相凝胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的步骤,每步10～15min。第一步是将IEF胶在375mmol/LTris-HClpH8.8缓冲液(含2%SDS、1%(m/V)DTT或TBP、6mol/L尿素和30%甘油)中浸泡10～15min,尿素和甘油是用于减缓电渗效应,提高蛋白质从第一相到第二相的转移率。第二步是用5%(m/V)碘乙酰胺替代还原剂DTT的375mmol/LTris-HCIpH8.8缓冲液,其他组分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱氨酸残基,以便巯基不能重组形成二硫键。此外,碘乙酰胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT,否则自由DTT在第二相SDS胶迁移,会产生点条纹的假象。为减少酰氨基组的烷基化,最好在pH8～9之间进行还原和烷基化。胶条两步平衡略微放慢了双向电泳进程,因此试图用一步SDS法完成平衡,在平衡液中用TBP和丙烯酰胺取代DTT,TBP不带电,在SDS过程中不迁移;或者在IEF前进行蛋白质的还原和烷基化。但是TBP与丙烯酰胺法烷基化巯基不及两步法DTT和碘乙酰胺处理充分。IEF前烷基化改变了蛋白质的等电点,由此也改变了电泳图谱。此外,在硫脲存在的体系中用碘乙酰胺不能实现有效的蛋白质烷基化。若分离的蛋白质一旦被还原、烷基化和SDS饱和,将它们转移至第二相是相对简单的事情。平衡后的IPG胶可以被水平或垂直放在SDS胶上,用0.8%低熔点琼脂糖封胶,固定IPG胶,以防电泳时滑动或漂移。电泳系统采用Laemmli非连续缓冲体系,SDS胶是单一浓度或含线性或非线性梯度的凝胶,其覆盖范围可以使不同分子量大小蛋白质得到有效分离。根据IPG胶的长度,可以制备不同长宽的SDS胶,从微型胶大约7cm×8cm或13cm×9cm直到大胶25cm×20cm。各种大小的预制胶可以在一些公司买到。一般来说,胶愈大,分辨率更好,能够运载蛋白质的量也愈多。练习跑微型胶是为了摸索最佳样品制备的条件,而跑大胶用于详细分析。胶内蛋白显示灵敏度决定于蛋白染色技术。尽管有许多专一的染色方法,但是大多数SDS胶用考马斯亮兰(coomassiebrilliantblue,CBB)、SYPRORuby(SYPRO是美国分子探针公司商标)或一些银染方法染色。对蛋白质组学研究工作而言,蛋白质染色方法必须与质谱兼容,因而限制了包括戊二醛处理或氧化步骤的银染方法的应用。考马斯亮兰和SYPRORuby染色法均与质谱兼容。当配成胶体溶液时,胶体状CBB易用且对环境无害。胶体CBB实际上是一种终点染色方法,SDS胶可以染色过夜,过染后可用水清洗。水清洗可以去除胶面上胶体染料颗粒,并且也驱使染料分子进入至胶内蛋白处。因此,水清洗增加了染色胶的信噪比。胶体CBB是上述3种染色法中灵敏度最低的,检测限度约为每点10ng蛋白。胶体CBB染色法可以染色多种蛋白质,并能与蛋白量呈两个最高数量级的线性关系。用胶体CBB染色的蛋白点成蓝色,且可以用可见光扫描仪捕获胶图。SYPRORuby是一种荧光染色法,也是一种终点染色方法,可以检测到大约1ng的蛋白点。SYPRORuby与蛋白量呈3个最高数量级的线性关系。需用荧光扫描仪显示用SYPRORuby染色的蛋白点。银染是一种高灵敏度、非放射性的蛋白染色方法,可以检测到小于1ng的蛋白点。但线性范围小于2个最高数量级。而且银离子和甲醛或戊二醛会对蛋白质的α和ε-氨基进行烷基化,妨碍了胶内蛋白质的Edman测序分析。所有银染方法都是温度依赖的,而且需要精确控时的操作,决定何时终止染色全凭个人的经验,因此,银染是上述3种染色法中重现性最差的。没有一种通用的染色方法可以与胶内的所有蛋白发生反应,因此,在实验的某个阶段用2种或2种以上的染色方法是有效的。双染色是可行的,可以显示胶内不同蛋白的染色特性的差异。如常常先用SYPRORuby或银染染色,然后用胶体CBB染色。获取数字化图像是进行蛋白胶图匹配分析的第一步。2-DPAGE图像获取仪可有一般的文件扫描仪、电荷偶联(charge-coupleddevice,CCD)照相系统和基于激光的检测器等。对CBB或银染染色胶,一般在可见光下可以用文件扫描仪采取图像,以TIFF格式保存图像文件。CCD照相系统可以在可见光或荧光条件下采集图像,高灵敏度的CCD照相系统带有冷却系统,可以增加其信噪比。基于激光的检测器是最灵敏的图像获取仪,专用于荧光染色的凝胶,常采用多光管检测。对于任何大小的2-DPAGE凝胶,需要100～150m的图像分辨率。为了获得最好的定量结果,成像仪应与分析软件匹配,最方便的配置是用分析软件控制成像仪。图像分析软件是高通量蛋白质组学研究的核心。目前常用的图像分析软件有PDQUEST(Bio-Rad)、MELANIEⅡ(SIB,GenBio)、Imagemaster(APB)、Advanced2-DSoftware(Phoretix)和HTIvestigator(GSI)。图像分析软件能提供综合管理各种分离和分析过程所必须的控制和分析的功能。尽管胶图能被直观检测,但是大多数蛋白点的客观定量和比较需要计算机的辅助分析。2-DPAGE分析软件确定并定量2-D凝胶上蛋白点,去除背景方式,匹配相关胶图,比较相关胶图上相应蛋白点强度,准备显示报告的凝胶数据以及输出胶图信息到数据库。图像分析软件也能指导手工或点自动切割机械手进行胶上蛋白点的切割,以作进一步的分析。例如,通过相关蛋白样品如对照和处理细胞的胶图比较分析能够明确差异表达的蛋白质,并在合适凝胶上选择切割。另一方面,对特定源的蛋白作图,仅切割和分析样品中的高丰度蛋白(以最强的蛋白胶点为代表)。计算机产生的切点目录驱动在完整体系中的切点工具,并大大简化了在许多蛋白点切割时点的收集、管理和记录。1.2检测产物的分离和分析最初,高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)被用于作为分离蛋白质或多肽的一种方法,在技术上主要采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器,具有分析速度快、分离效率高和检出极限低的特点。近年来,高效液相色谱已成功应用于蛋白质组学中,它主要与高通量的质谱仪联用,构成自动化的液质联机。OpiteckGJ等研制出一套自动化程度很高的二维的HPLC方法,其分离原理与双向电泳相似。先根据蛋白质大小用排阻色谱(正相柱)分离蛋白质,馏分自动进入反相液相色谱(反相柱),便得到了二维色谱图。然后将分析物转移至96空板上,进而自动加到MALDI-TOF-MS靶上进行鉴定。利用该方法在转基因的大肠杆菌裂解液中成功鉴定出两种基因产物,非受体酪胺酸激酶和β-内酰胺酶src同源结构域。该方法具有以下优点:1.样品可以重复多次分离;2.加样过程、分离过程和馏分收集过程均可以自动化;3.洗涤液中的蛋白质可以直接用质谱分析。但目前该方法的分辨率不高。反相高效液相色谱(reversephaseHPLC,RP-HPLC)是LC-MS的核心部分,前接排阻色谱,后连质谱仪。RP-HPLC一般用非极性固定相,流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RP-HPLC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。RP-HPLC分离原理比较简单,主要根据蛋白质的疏水特性分离不同蛋白组分。在高速移动水相中,蛋白质粘附在RP-HPLC柱,然后用高速移动有机相洗脱RP-HPLC柱,并自动收集不同馏分。由此可见,蛋白质按流动有机溶剂的线性梯度获得分离。挑选一根合适的RP-HPLC柱,需要考虑以下3个因素,1.柱的大小,2.颗粒和孔径大小,3.柱的固定时间。一般柱的大小用柱的内径和长度表示,柱的内径为0.05～4.6mm,长度为100mm是较适宜用于LC-MS。最常用的颗粒是硅颗粒,颗粒大小为3～50μm,孔径大小100～1000埃,其中5μm大小300埃孔径的硅颗粒最适宜用于蛋白质或多肽的分离。柱的固定期常由疏水的烷基链决定。C4、C8和C18是3种常用链的长度。C4常用于蛋白质,而C8和C18用于捕获短肽和小分子物质。RP-HPLC柱流动相包括水相和有机相,其中水相由HPLC级水和0.1%的甲酸组成,HPLC级乙晴和0.1%的甲酸构成有机相。1.3化学表面检测近年来,美国Ciphergen公司发明了SELDI(surfaceenhancedlaserdesorption/ionization)蛋白芯片技术,它将蛋白质分离与质谱分析集于一体,实现了一步分离与鉴定。SELDI芯片技术是利用系统设计的具有不同化学表面修饰的芯片,使之能选择性地富集一组蛋白质,在添加能量吸收分子以后,送入阅读机,以MALDI(matrixassistedlaserdesorption/ionization)飞行时间质谱检测和测定被富集到8～24个样品点上的所有蛋白质。蛋白质芯片系统通过测定蛋白质分子的飞行时间,检测并且迅速计算出蛋白质的分子量。该系统可以识别小于1kDa的多肽,直至500kDa以上的蛋白质。对一个样本的分析在几十分钟就可以完成,处理的信息量远远大于二维电泳。对于低丰度蛋白,即使浓度仅为attomole(10-18),只要与表面探针结合,就可以检测到。SELDI蛋白质芯片系统能提供大量的不同化学吸附表面,可以从复杂的蛋白质混合物中特异获取某类蛋白质,而且在一定程度上可以调节蛋白质的数量范围。化学表面包括一系列的经典化学层析和专门的亲和吸附表面。经典化学层析包括正相的多数蛋白结合表面;反相吸附的疏水表面;正负离子交换表面;吸附结合金属蛋白的结合金属亲和吸附表面(IMAC)等。专门的蛋白质也能被结合在预先活化的芯片表面,使得研究可以进行抗原-抗体、DNA-蛋白质和受体结合的研究。根据上述芯片的性质,Ciphergen公司专门设计出可用于不同检测目的的蛋白芯片,除NP1和NP2一正常芯片可用于分析大多数亲水蛋白以外;还有H4—疏水表面芯片、PS1,PS2—预激活表面芯片、SAX2-强型阴离子交换芯片、WCX2—弱型阳离子交换芯片、IMAC3—固定金属亲和结合芯片等。NP1和NP2芯片表面含有氯化硅,允许蛋白质通过Ser,Thr,Lys氨基酸残基结合于其上,可用于快速分析样品中的蛋白质、确认某一分子是否存在于样品中以及检测样品纯度。H4芯片表面有16个亚甲基组成的链,通过反向化学结合富含Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Try的蛋白质,用于鉴定蛋白质样品的纯度、快速进行蛋白质的分析和生物标记分子的检测。PS1和PS2芯片表面是重活化的碳氧基二咪唑部分和环氧基,因此可用于抗原与抗体、受体与配体、核酸与蛋白质、特异性蛋白与蛋白之间的检测。SAX2芯片表面上含有带阳离子的季铵基团,它可以与蛋白质表面的负电荷作用,如Asp,Glu,可以用于分析某一PI范围的蛋白质。WCX2芯片表面上含有弱阴离子羟基,能与表面带正电贺的蛋白质结合,如Lys,Arg,His,可用于高等电点蛋白质的选择性分析和生物标记分子的检测。IMAC3芯片表面上含有亚硝基,用于螯合金属离子蛋白质,通过His,Try,Lys位磷酸化的氨基酸与金属离子结合,可用于分析结合蛋白、分析磷酸化的蛋白质、分析His标记的蛋白质和生物标记分子的检测。蛋白芯片阅读器实际上是一个激光解吸和离子化的飞行时间质谱,该质谱仪采用最新发展的离子光学和激光光学技术。激光光化学性质可以在尽可能大的样品检测面积中,最大程度提高离子化效率,从而增加了分析的灵敏度和可重复性。阅读器的光学离子部件结合了一个四极杆的离子透镜,大大提高了检测蛋白分子的敏感度和精度。SELDI蛋白质芯片系统的大部分的工作流程包括在芯片上进行的若干样品结合和洗涤步骤。通常,几微升经过适当前处理或者未经处理的蛋白样品被点加到蛋白芯片的活化表面上,芯片通过特异性的化学表面或生物分子共价偶联的表面捕获蛋白质。经过适当强度的洗涤,一部分目标蛋白将留在芯片的表面上。当能量吸收分子(energyabsorptionmolecule,EAM)滴加到芯片表面,它将和芯片表面的目标蛋白一起形成一个粗结晶体。EAM分子对介导分子的离子化至关重要。Ciphergen公司提供几种不同的EAM分子以供选择。处理完的蛋白芯片送入蛋白质芯片阅读机进行质谱分析。当激光打到样品上时,样品结晶发生离子化和解吸附。激光能量、EAM和分析物之间的相互作用究竟如何导致分析物的离子化,目前仍不十分清楚。但其结果一是引起分析物的电离,二是分析物晶体被转变为气相,并在电场中快速运动,或称为“飞行”。带有正电荷的蛋白质被排斥而飞离正极金属片。当一定电压下的电场能量施加到蛋白分子上时,其飞行速度取决于其质量(e=mv2,其中e=能量,m=质量,v=速度)。蛋白芯片阅读器精确记录被检分子的飞行时间并据此给出其分子量。1.4质谱法质谱再利用的新突破20世纪80年代末期,因两项软电离质谱技术一基质辅助激光解吸附质谱技术(matrixassistedlaserdesorption/ionization,MALDI)和电喷雾质谱技术(electrosprayionizationmassspectrometry)的发明,使得传统的主要用于小分子物质的有机质谱技术取得了突破性进展。基质辅助激光解吸附质谱技术和电喷雾质谱技术具有高灵敏度、高通量和高质量的检测范围等特点,使得在pmol(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能,从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域,并得到迅速发展。1.4.1指纹肽质量图MALDI-TOF-MS由主机、计算机控制系统、打印机、仪器控制和应用软件组成。主机是由基质辅助激光解吸附离子源(MALDI)、“V”型飞行管(timeofflight,TOF)、线性和反射离子检测器、激光器、真空系统、电子控制和数据处理等几部分组成。MALDI离子源主要由样品靶、脉冲离子引出或延迟引出单元、离子透镜、样品靶机械手、高倍数靶位视频监视器、高压电源和控制等部分组成。1993年,5个研究小组分别提出了肽质量指纹图谱的概念。这个概念是指蛋白质或多肽被特异性的酶如胰酶Trypsin,Lys-C等酶切后再用质谱进行肽混合物质量测定,会得到一套具有特征性的肽质量图,这种特性像指纹一样,每种蛋白质均具有特定的肽质量图。然后通过与数据库中所有蛋白质的理论酶解的肽质量相匹配来鉴定蛋白质。得到酶解肽质量指纹图最快的方法是通常与飞行时间(TOF)结合的MALDI质谱。这种方法仅需要少量体积的酶解肽段溶液点在MALDI板上,余下的可以做ESI-MS/MS分析。商业化的MALDI-TOF-MS装有最多1024个样品靶位,软件可以自动进行数据采集。样品制备是获得较好肽质量指纹图的关键。如果样品同源,使用最佳的肽、底物比例,几次激光发射完全可以不搜寻样品位置而获得较好的谱图。近年来,采用基质晶体沉淀的母型结晶层的样品制备技术,使得每个样品在15s内使用16次激光发射就可获得质谱图。一般来说,所有1000以上的峰都是带单个电荷的肽,易得到数据,也能获得较高的信噪比。目前使用在800～3000m/z质量范围的自然内标如胰蛋白酶的自切峰能将误差保持在5ppm以下。如果数据库中提供指纹肽谱,就能很快鉴定蛋白质,但在检索基因组或EST数据库时,该技术不易成功。使用两种以上数据库交叉检索可以减少随机的噪音因素。对于PMF来说,MALDI-TOF质谱仪的质量误差范围是非常重要的参数。现在MALDI-TOF质谱仪引用了离子反射器和延迟提取技术,通过内标校正,质量误差可以达到10～30ppm,鉴定一个蛋白质通常需要匹配4～5个肽段的质量以及20%的序列覆盖率。1.4.2质量分析器质点1989年,FennJB等首次用电喷雾离子化质谱(ESI-MS/MS)技术在pmol/L(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上成功检测核酸和蛋白质等生物大分子的质量及片段序列。由此将电喷雾质谱技术引入到生命科学领域,他因此于2003年获得诺贝尔化学奖。在ESI源中,含有多肽或蛋白质的溶液流经一个细小的进样针,在针的出口处施加高电压(1000～5000V)用以产生正离子。高电压使样品液流分散为呈雾状的带高电荷的微小液滴。在质谱仪入口端的带孔平板上加有100～1000V的低电压,引导离子通过入口,这一入口是离子源和质谱仪的连接处,离子源处于大气压环境,而质谱仪处于真空状态中。当液滴从针尖通往入口时,在定向惰性气体流的作用下溶剂蒸发,使液滴表面缩小,液滴电荷密度增加,最终导致液滴爆裂,离子从液相中释放出来进入气相。离子通过入口后,在一个带有射频场的四极杆控制下进入质量分析器。质量分析器可以是四极杆、四极杆一飞行时间或离子阱。ESI产生的多肽离子的特征是带多电荷,电荷数与肽分子中可电离的基团数目有关。如果用ESI-MS正离子模式分析胰酶酶切肽段,大多数肽段都会带至少两个电荷,一个在N末端的NH2基团上,另一个在胰酶酶切位点,肽段C末端碱性氨基酸的侧链上。纳升电喷雾离子化质谱的离子源的结构特殊,经其产生的液滴比普通电喷雾质谱产生的液滴小100倍,因而有效利用了样品,减少了损失,提高了灵敏度。该方法特别适用于微量样品的质谱分析,如用纳升电喷雾离子化质谱可以成功鉴定经SDS胶分离的蛋白质。用PMF方法只有在MALDI-TOF-MS分析中匹配到4个以上的肽段质量并且数据库中存在这种蛋白质才能得到阳性鉴定。实际上,有一部分蛋白质点用PMF方法不能得到可靠的鉴定结果。因此需要进一步获得肽段的序列信息,即肽序列标签(peptidesequencetag,PST),一般用串联质谱ESI-MS/MS测得。1994年,EngJK等提出用串联质谱碎裂方式进行单个多肽鉴定的概念,它类似于肽质量指纹谱的鉴定方法。20世纪80年代Hunt小组提出低能量的三级四极杆质谱仪和Biemann提出高能量的四扇形磁质谱开创了多肽串联质谱的历史。第一质量扫描阶段用于离子通过含有碰撞气体(如氩气)的高压区加速前分离单个多肽离子;第二质量扫描阶段用来测定碰撞诱导或活化解离(collision-induceddissociation,CID)产生的多肽碎片质量。利用装有离子闸门和反射镜的TOF仪器,增加激光能量,即可获得源后衰变(postsourcedecay,PSD)谱。在股流膨胀(plumeexpansion)和离子加速阶段,多肽离子与基质多次碰撞导致大部分MALDI解吸离子到达质量检测器前延迟碎裂。肽段离子断裂的方式具有序列特异性,主要是沿肽骨架的肽键断裂。如果肽离子的正电荷保留在碎片离子的N末端,此离子被称为b系列离子,用下标数字代表这一碎片离子中的氨基酸残基数目,从N末端起为1。因此,b离子代表C末端确失,N末端完整的碎片离子。如果正电荷保留在碎片离子的C末端,此离子被称为y系列离子,也用下标数字代表这一碎片离子中的氨基酸残基数目,从C末端起为1。因此,y离子代表N末端确失,C末端完整的碎片离子。多肽的碎片质量可以在序列数据库中搜索类似的多肽。1.5icat标记的ms/ms分析分离的分子虽然双向电泳的分辨率和重复性已得到很大提高,但是图谱的匹配分析仍然存在一些问题如一些蛋白点在不同批试验中或同一试验不同胶上总会发生迁移,所以很难对这些蛋白质进行定量分析。目前用同位素亲和标签(isotope-codedaffinitytags,ICAT)化学试剂结合质谱的方法可以较好地实现蛋白质差异表达的定量分析。ICAT是一种人工合成的化学试剂,其结构包括专一的化学反应基团(与蛋白质的Cys反应)、同位素标记的连接子和亲和反应基团(一种生物素)。其连接子可由8个氢原子(H)或氘(D)分别标记,由不同原子标记的ICAT分子量相差8Da。当不同处理条件的细胞或组织裂解后,分别用不同的ICAT标记总蛋白,ICAT反应基团会专一地与蛋白质中的半胱氨酸共价结合,待反应结束后,将两者等量混合,再用胰酶消化。经亲和层析后,含生物素ICAT标记的酶解片段就可以进行LC-MS/MS分析。由于一对ICAT标记的两个不同样品的相同肽段在MS质谱图上总是一前一后且相差8Da或4Da(两个电荷)。比较这两个峰值,就能得到有差异表达的蛋白质,并用MS/MS鉴定出何种蛋白质。ICAT具有广泛的兼容性,可以分析来自不同器官、组织、细胞等绝大部分蛋白质,可以兼容多种生化和物理的分离方法,因此能较好定量分析低丰度蛋白质。但是ICAT也存在一些不足之处。由于ICAT分子量约500Da,这对小肽段而言是一个较大的修饰物,会增加数据库搜索的复杂性。近年来,发展了新一代的cICAT(cleavableICAT)试剂。cICAT在原来的基础上做了一些改进,其连接子分别由9个12C和13C标记,这样由不同原子标记的ICAT分子量相差9Da。在同位素标签的连接子和亲和反应基团之间增加了一个酶解位点,在ICAT标记的肽段分离纯化后可以通过酸裂解将亲和反应基团生物素切去,裂解后的同位素标签的分子量只有227(236)Da,大大减少了数据库搜索的复杂性。cICAT定量蛋白质组分析一般采用两种策略,第一种策略是分别用cICAT的12C和13C标记两个样品的蛋白质,然后等量混合后进行酶解,再过阳离子交换柱,亲和层析柱纯化,最后进入在线LC-ESIMS/MS或2D-LC-ESIMS/MS分析,也可以经过离线的LC或2D-LC分离,用Probot自动点样器将样品点在MALDI板上,再进行MALDIMS/MS分析。第二种策略是将标记好的蛋白质等量混合后直接用SDS分离,然后取蛋白质条带进行酶解,酶解物用亲和层析柱纯化后再进行LC-MS/MS分析。1.6蛋白质联系网络的建立细胞内蛋白质的分布不是无序的,蛋白质与蛋白质之间存在相互作用,这种作用不仅表现在蛋白质之间的物理互作,而且也体现功能互作。蛋白质与蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。这种千变万化的相互作用形成了复杂的蛋白质联系网络。蛋白质之间的相互作用及作用方式也是蛋白质组学研究的重要内容。研究蛋白质间的相互作用的方法有酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫沉淀、蛋白质交联等,其中酵母双杂交系统和串联亲和纯化是目前发展迅速、应用广泛的高通量检测蛋白与蛋白互作的主要方法。1.6.1转录激活因子酵母双杂交系统(yeasttwohybridtest)是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明,酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。酵母双杂交系统是基于真核生物转录因子的结构而建的。由于转录因子的结构是组件式的,往往有两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中包括DNA结合结构域(DNAbindingdomain,DB)和转录激活结构域(activationdomain,AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽能与启动子结合,但是不能激活转录。而不同的转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Ga14蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母,这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4,又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE,因此,酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1,从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来,从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。1989年,FieldsS等正式建立了酵母双杂交系统。他们以调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snfl和Snf2为模型,将Snfl与Ga14的DB结构域融合,另一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白分别称之为“诱饵(bait)”和“猎物”或靶蛋白(preyortargetprotein)。如果在Snfl和Snf2之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报告基因(reportergene)。通过对报告基因表达产物的检测,反过来可以判别作为“诱饵”和“猎物”两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此FieldsS等采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报告基因,并且在该基因的上游调控区引入受Ga14蛋白调控的GAL1序列,这个改造过的LfacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(GAL80是Ga14的负调控因子)被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。因为Snf1和Snf2之间存在相互作用,结果发现只有同时转化了Snfl和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。1.6.2离技术的分析方法众所周知,大多数细胞功能或细胞内信号转导过程的完成是通过蛋白复合体(proteincomplexes)而不是单个蛋白质来体现的。对于蛋白质复合体研究最经典的方法是通过生化的方法纯化蛋白复合体,然后用质谱鉴定其组分。纯化蛋白复合体一般需要多种不同的分离技术,但通常包括以亲和为基础的分析方法,如免疫共沉淀等。1999年,RigautG等发展一种串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)蛋白复合体的方法。TAP包括蛋白A和钙调蛋白两个标签,在这两个标签之间有一个蛋白酶的切割位点,将TAP-标签的基因与目标蛋白基因融合,然后导入宿主细胞或组织使其表达,这样标记有两个TAP-标签目标蛋白以及与目标蛋白相互作用的蛋白质组分就可以用两个串联且配基不同的亲和色谱进行有效的分离纯化,然后将纯化的蛋白质复合体经SDS胶分离,得到不同分子量条带,每条带代表复合体中的一个亚基,切下每个条带,进行胶内酶切,再进行质谱检测,即可鉴定复合体中每一组分蛋白。该方法已经应用于大规模的蛋白质组研究,并已经有成功的报道,如酵母的232个不同的蛋白质复合体就是通过这种方法被鉴定。1.7数据库-图像的链接一般情况下,关于蛋白与凝胶图像中蛋白点之间的许多描述性信息,如蛋白质名称、分子量/等电点(Mr/pI)值、目录性信息以及其他文献信息均储存在2-D数据库中。数据库应对所分析的一组图像的代表图像给予明确的注释。这个代表图像可以是被分析凝胶图像之一或者是一个合成的标准图谱。因此,这种图像-数据库和数据库-图像的链接应有以下提示:1.如果一个蛋白点在图像中标出,应该显示其相应的描述信息;2.若某个蛋白的名称或其他描述信息已知,就应显示该蛋白点在图像上的位置并加以解释。一些图像分析软件包括相应的内部数据库。如在Bio-Rad的PDQUEST中,除了标准的蛋白点号(SSP),一般内部数据库也给出一个蛋白点号(DSN),这个号码按Mr/pI晶格排序。每个蛋白点有不同的注释类别,这种注释直接与标准胶上蛋白点的位置有关,并能通过简单查询得到。图像分析软件中的内部数据库是系统特异的,其凝胶图像和描述信息对外不共享。目前,网上可以检索到各种2-D数据库。如在ExPASy服务器的WORLD-2DPAGE上可以检索到大约30个2-D数据库。在网上还可以免费使用构建2-D数据库的软件包,如Make2dbb。这个软件包的使用不依赖于MELANEⅡ系统,而且还包括一个新的工具,可以使凝胶的TIFF图像、含有x/y参数坐标的蛋白点的TEXT文件和SWISSPROT的注册号转换成特定的图像格式。1.7.2利用一个数据库鉴定细胞。具体的搜索引擎名称及其网址见表2。现有的数据库如NCBI、SWISS-PROT、OWL和MSDB等均为支持上述搜索引擎的蛋白质数据库。在MASCOT中,有5个数据库如:NCBI、SWISS-PROT、MSDB、RANDOM和OWL支持,一般在搜索时任选其中一个。已知某物种专一的蛋白数据库,对利用质谱数据鉴定蛋白质非常重要。目前在MASCOT中已有40～50个物种可以利用质谱数据鉴定蛋白质。对于已经测序的物种,如拟南芥和水稻,常有较完善的蛋白库,因此利用质谱数据鉴定蛋白质常能得到有效的匹配。而对于未测序的物种,如玉米、小麦等,一般蛋白库不完善,有些种只有EST库,尽管在实验中得到许多的质谱数据,但是往往得不到阳性鉴定的结果。1.7.3酵母蛋白与蛋白互作数据库mips目前,蛋白与蛋白或蛋白与其它分子的相互作用已有广泛研究,并积累了许多的蛋白与蛋白互作的原始数据资料。这为生物信息学家构建相应数据库或蛋白与蛋白互作网络提供了非常丰富的数据信息。酵母双杂交系统是高通量检测蛋白与蛋白互作的方法之一,现已有一些商用数据库,如PathCallingofCuragen()、ProNetofMyriadGenetics()等(表3)。BIND(BiomolecularInteractingNetworkDatabase)是一个生物分子互作网络数据库,主要以计算机阅读格式贮存各种分子互作、复合体和代谢途径的实验数据。同时可用于蛋白与蛋白互作、分支代谢途径作图和产生动态模拟信息的研究。PIMRider()是一个连接不同途径蛋白的软件包,可以搜索到基于一系列酵母双杂实验建成的蛋白与蛋白互作图谱。DIP(TheDatabaseofInteractingProteins)是一个蛋白互作数据库,该库包含蛋白与蛋白互作及其互作网络的数据,对了解蛋白功能和蛋白与蛋白间的关系及其研究蛋白与蛋白互作网络特性非常有用。Interact(http://bioinf.man.ac.uk/umber/resources/interacts.html)是一个基于MIPS的酵母蛋白与蛋白互作表格的数据库,该库可以免费使用。此外,基于蛋白序列和基因组信息预测蛋白与蛋白互作的计算机方法已被建立。2双向电泳的缺陷蛋白质分离和鉴定技术的发展与许多动植物基因组计划的实施与相继完成,使蛋白质组学得以诞生和发展。蛋白质组学是在基因组学的基础上研究蛋白质的表达与功能的科学,是建立在从cDNA阵列的mRNA表达谱的基因功能分析,基因组范围的酵母双杂交,蛋白质与蛋白质相互作用分析到蛋白质表达、测序和结构分析等诸多不同实验方法相互融合基础上的科学。屈指算来,从1995年蛋白质组学概念的提出到现在,蛋白质组学的研究已历经整整11年。在此期间,已出版了多个有关蛋白质组学研究的杂志如Proteomics、Molecular&CellularProteomics、JournalofProteomeResarech等。全世界每年要发表成百上千篇与蛋白质组学相关的论文。这些论文主要涉及用蛋白质组技术探讨生物学问题、药物设计和药靶的发现、蛋白质的分离与鉴定技术的改进以及新蛋白组的数据库建立。因此,蛋白质组学研究与应用有着广阔的发展前景。蛋白质分离技术是蛋白质组的3大核心技术之一,是保证蛋白质能否被有效鉴定的基础。双向电泳技术是目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术,具有相对简便、快速、高分辨率和重复性等优点。因此,在目前发表的与蛋白组学研究相关的论文中,有80%的论文中涉及双向电泳技术。虽然双向电泳技术具有其他蛋白质分离技术无可比拟的分离能力,目前仍然存在着一些技术细节上的挑战和缺陷。主要有以下几个方面:1.蛋白样品制备效率偏低。样品制备是双向电泳的第一步,其成功与否是决定双向电泳分离能力高低的关键。在蛋白质样品提取过程中,一些低丰度蛋白质往往会相对过早丢失。此外,一些难溶的蛋白,尤其是膜蛋白的提取效率较低。目前一些公司如Bio-Rad研制出一种顺序提取试剂盒(sequentialextractionkit),专用于提取一些难溶的膜蛋白。2.疏水性膜蛋白的难于分离与检测。一般来说,疏水性膜蛋白比亲水性蛋白质更难操作。膜蛋白更易于聚集在管壁上,由于蛋白质组的研究常在nmo