抗结核药物的靶位与靶位

抗结核药物的靶位与靶位

核电站杆菌是一种非常顽固的病原体。每年800万人感染淋巴结，200万人死亡。世界上大多数人口都感染了伏击测试菌。耐药结核病和HIV感染不断增加削弱了宿主的疾病防御体系,致使潜伏态病菌复苏或感染那些易感人群,这就使有效地控制结核病的工作面临进一步的挑战。尽管结核病用化疗法可治愈,但需要至少服药6~9个月。除明显的毒性外,长疗程也导致患者的依从性较差,从而发生药物的选择性耐药,而且通常是致命的多药耐药。目前对结核病的治疗主要是由一线药物异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇联用的疗法,疗程为6个月。如果由于细菌的耐药性或患者对一种或多种药物的不耐受而导致治疗失败,则使用二线药物,即对氨基水杨酸、卡那霉素、氟喹诺酮、卷曲霉素、乙醇硫异烟胺和环丝氨酸,这些二线药物通常较一线药物的疗效差,且具有更严重的不良反应。由于在受损害的部位存在代谢沉默、持留或休眠细菌,而抗分枝杆菌的药物通常只能杀死生长期的细菌,不能杀死持留的细菌,这就使得对潜伏期TB的治疗异常困难。缩主细胞与分枝杆菌相互作用,分枝杆菌循环性重复感染宿主巨噬细胞,从而延长了杆菌的存活期和持留,因而使损伤部位的细菌几乎不可能被完全杀灭,这就是结核分枝杆菌能抵抗化疗和宿主免疫进攻,并在潜伏状态下生存数十年的独特能力,因此很难治疗和根除。由于在结核损伤部位存在异种菌群,或许由于宿主缺乏免疫力,必须采用多药联用,且延长治疗时间,以预防持留杆菌引起的结核病复发。因此,在有关结核病的研究中,在很大程度上侧重于对持留菌的生物学特性的研究以及能更有效杀死持留杆菌的疗法研究。多药耐药结核分枝杆菌的不断增加迫使人们研制即对耐药结核分枝杆菌有效,又可缩短疗程的新药。在过去40年里未研制出新一类的抗结核药物。在研制新的抗结核药物时,考虑结核分枝杆菌中的哪些靶位是良好的药物作用靶位是至关重要的。最近已有很多这方面的综述文章。本文将阐述更新的抗结核药物进展情况。1希望替代药物1.1抗结核药物的活性最近发现的二芳基喹啉(图1)因其可缩短治疗时间成为有希望的抗结核药物。Andres等在体外用快速生长的耻垢分枝杆菌进行药物筛选得到一组具有很高抗分枝杆菌活性的二芳基喹啉化合物,在对其进行结构改造后获得一个对分枝杆菌作用活性最强的化合物R207910,其对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的MIC分别为0.003和0.0301μg/ml,对其他菌种如大肠埃希菌和金葡菌的活性较低(MIC>32μg/ml)。结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌对二芳基喹啉发生耐药性的频率为1×10-7~1×10-8。通过对耐药耻垢分枝杆菌和耐药结核分枝杆菌的研究发现,由atpE基因编码的亚单位c发生了变异,atpE位于分枝杆菌的F1F0质子ATP合酶的F0部分,而该酶又是ATP合成和细胞膜生成的关键酶。进一步研究确定,atpE基因突变是分枝杆菌对二芳基喹啉产生耐药性的根源,并提出二芳基喹啉的作用靶位是分枝杆菌F1F0质子ATP合酶,该酶是分枝杆菌中新的药物作用靶位。R207910还具有抗MDR-TB的活性,根据转座子诱变分析,F1F0质子ATP合酶是结核分枝杆菌中的必需酶,该酶对大肠埃希菌并不是必需的,因在小鼠模型中F1F0突变株仍有活力,只是生长速率降低,致病力衰减。在已确定感染小鼠模型中,R207910对结核分枝杆菌的活性高于异烟肼和利福平,且疗程可从4个月缩短至2个月。特别值得关注的是二芳基喹啉与吡嗪酰胺具有协同作用,二者联用是杀灭已感染的脾和肺中病原菌的最有效治疗方案。在小鼠和初步人体安全性试验中,R207910表现出极佳的早期和晚期杀菌活性、良好的药动学和药效学性质,其半衰期长,且无明显毒性,这些特性使人们寄希望二芳基喹啉能用于人类结核病的治疗,并使疗程缩短。然而,还需要对R207910的几个不寻常特性作进一步的解释。第一,抗分枝杆菌的药物通常对快速生长和慢速生长的分枝杆菌的杀菌活性不同,如异烟肼、利福平和吡嗪酰胺对慢速生长的结核分枝杆菌的活性较高,而对快速生长的耻垢分枝杆菌的活性较低,因后者存在外排机制。然而,二芳基喹啉对快速生长的耻垢分枝杆菌的活性高于结核分枝杆菌,这一现象是相当不寻常的。第二,在小鼠模型中,早期和晚期均有很高的杀菌活性是不寻常的,因为其他的抗结核药物仅有早期或晚期的杀菌活性。第三,二芳基喹啉类选择性地作用于分枝杆菌F1F0ATP酶,而且未产生明显的毒性,该事实令人不可思议,因为该酶不仅存在于所有分枝杆菌中,而且还存在于宿主细胞线粒体中。第四,分枝杆菌应该可通过电子传递链等方式产生能量或ATP,而并非通过F1F0ATP酶,故二芳基喹啉对F1F0ATP酶的抑制作用是非致命性的,除非R207910也可以作用于分枝杆菌中的其他药物作用靶位。对于R207910的研究正处于临床试验阶段。1.2莫西瓜星的联合疗法氟喹诺酮是广谱抗生素,目前作为结核病的二线治疗药物。新的C8甲氧基氟喹诺酮莫西沙星和吉米沙星较氧氟沙星和环丙沙星具有更长的半衰期及更强的抗结核分枝杆菌活性。莫西沙星能够杀死利福平不能杀死的结核杆菌亚群,在小鼠模型中,莫西沙星对结核分枝杆菌的活性与异烟肼相当。莫西沙星与异烟肼和吡嗪酰胺联用对小鼠体内结核杆菌的杀菌作用较标准疗法(异烟肼+利福平+吡嗪酰胺)更有效,并4个月即可治愈,无复发。这些研究结果增强了用莫西沙星代替异烟肼+利福平+吡嗪酰胺,以缩短结核病治疗时间的希望。在初期人体试验中,与异烟肼相比,莫西沙星对结核分枝杆菌具有早期杀菌作用及良好的耐受性。含有莫西沙星的联合疗法与目前标准联合用药的疗效相当。目前正在进行临床试验评价莫西沙星和吉米沙星与利福平和吡嗪酰胺联用的疗效。这2种药物有可能用作结核病治疗的一线用药。1.3利福拉齐抗菌活性为了提高利福霉素类药物抗分枝杆菌的活性并延长其半衰期,已合成了其衍生物利福喷汀、利福布汀和利福拉齐。1998年FDA已批准利福喷汀用于治疗结核病,该药(每周给药1次)使用安全,耐受性好,目前正在进行Ⅲ期临床试验以评价其治疗潜伏期结核病的疗效。利福拉齐是新的半合成利福霉素衍生物,半衰期长,对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体和幽门螺旋杆菌有很高的抗菌活性。在小鼠体内外试验中,利福拉齐对结核分枝杆菌的活性高于利福平和利福布汀。耐利福平菌株能使所有利福霉素类(包括利福拉齐)产生交叉耐药,故治疗耐利福平结核杆菌引起的结核病时,限制使用利福拉齐。初步人体安全性研究表明,利福拉齐在剂量为10和25mg是安全的,而在100mg以上时会产生流感样症状和暂时的剂量依赖性白细胞和血小板减少,而其疗效并不比利福平好。利福拉齐用于治疗分枝杆菌感染的临床试验数据还未见报道。1.4唑烷酮和利奈唑胺噁唑烷酮类具有明显的抗结核分枝杆菌活性,MIC为2~4μg/ml,在小鼠模型中也有抗结核杆菌的活性。Sbardella等已证实3-(1H-1-吡咯基)噁唑烷酮具有抗分枝杆菌的活性。RBx7644和RBx8700具有抗MDR-TB和巨噬细胞内结核杆菌的活性。利奈唑胺是FDA批准的首个用于治疗单一或多药耐药的革兰阳性菌感染的噁唑烷酮类药物。在近期进行的2项临床研究中,大多数MDR-TB患者用利奈唑胺与其他药物联合治疗后康复,但由于在治疗MDR-TB时延长利奈唑胺用药时间,常常引起明显的毒性,如贫血和末梢神经病变。尽管噁唑烷酮类在治疗MDR-TB很有潜力,还需更广泛的临床研究评价其疗效和毒性,以及分枝杆菌对其产生耐药的程度。1.5pa984对细菌的活性硝基咪唑吡喃PA824是5-硝基咪唑衍生物(图2),对结核分枝杆菌和多药耐药结核菌具有很高的抗菌活性,MIC为0.015~0.250μg/ml。PA824是一种前药,需要由细菌F420葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Fgd)和硝基还原酶激活,被激活的组分可抑制细菌分枝菌酸和蛋白质的合成。被激活的PA824的有效部分还有待鉴定。对耐药的F420阴性突变株进行互补试验发现,Fgd能修复结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌对药物的敏感性。在动物模型中,PA824对非生长期的杆菌有活性(甚至在微需氧的条件下),其活性与异烟肼、利福平和莫西沙星相当。在小鼠模型中,PA824在治疗的最初2个月和延长治疗期均具有杀菌活性,这表明PA824对非生长期持留杆菌有明显的体内活性。还需进一步的研究评价PA824与其他药物联用是否能缩短治疗时间而无明显的复发,以及耐药性和毒性。目前全球抗结核药物开发联盟正在对PA824治疗结核病的疗效进行临床评价。1.6sq109和乙胺丁醇对小鼠抗结核分枝杆菌活性的影响治疗其他疾病的药物如抗真菌的唑类、酚噻嗪类(氯丙嗪和甲硫达嗪)和氯苯酚嗪衍生物(如氯苯酚嗪)均有良好抗结核活性,可作为治疗结核病的候选药物进一步评价。乙胺丁醇类似物SQ109具有良好的抗结核分枝杆菌活性,MIC为0.5μg/ml,而乙胺丁醇MIC为5.0μg/ml。在小鼠模型中,SQ109对巨噬细胞中的结核分枝杆菌较乙胺丁醇有更高的抗菌活性,但较异烟肼的活性低。SQ109与乙胺丁醇的作用机制不同,可抑制细胞壁半乳聚糖的生物合成,并在体内、外均有抗结核分枝杆菌活性,但还没有临床研究的相关报道。肽脱甲酰基酶抑制剂BB3497具有抗结核分枝杆菌活性,MIC为0.06~2.00μg/ml,可能成为有前景的结核病治疗新药。吡咯类LL3538正处于临床前研制阶段,是有前景的治疗结核药物。2疾病发病机制的作用靶位理想的药物作用靶点应是对细菌的生长、代谢和生存起关键作用的位点,这些位点的失活将导致细菌死亡或不能持留。已确定的结核分枝杆菌基因组序列和分枝杆菌的遗传工具(如转座子诱变、基因敲除、基因转移)为药物作用靶位的鉴定奠定了基础。此外,与疾病发病机制有关的靶点也可以作为药物的作用靶位,如从固体坏死灶到腔的形成这一液化作用是感染扩散到其他个体的关键步骤。若能够中止液化和腔形成,病灶部位的杆菌将不会传染给他者。因此抑制宿主的液化过程是用于设计可阻止结核传播的新药的一种新方法。新的抗结核药物不仅对耐药结核菌有抗菌活性并也能杀死持留菌以及缩短结核病的治疗时间。目前结核药物的作用靶位主要为DNA合成、RNA合成、细胞壁合成和能量代谢(表1)。目前的结核药物所不能抑制的在这些代谢途径中的酶也是良好的药物作用靶位。分枝杆菌的双组分系统、σ因子和毒力因子也可以作为结核药物的作用靶位。下面将讨论有可能与新药作用的新靶位。2.1特定基因的生成和功能转座子诱变和信号标签诱变技术已用于鉴别结核分枝杆菌体外生长和体内生存所必需的基因。现已发现614个基因是结核分枝杆菌体外生长所必需的,约占该菌总基因数的1/6,而194个基因是该菌在小鼠体内生存所必需的。体外和体内生存所必需的基因可按如下分类:脂类代谢、糖和氨基酸的转运和代谢、无机离子的转动和代谢、核苷酸的转运和代谢、能量的产生和转化、分泌、细胞生物被膜的产生、细胞分裂、DNA复制、重组和修复、转录和翻译、翻译后的修饰、伴侣蛋白、辅酶代谢和信号传导。然而这些必需基因中的很多功能是未知的。除采用转座子诱变技术系统分析必需基因以外,靶向敲除特定基因也是一种鉴定必需基因(即对这些基因的破坏会导致细胞死亡)的有效方法。这些分枝杆菌中的必需基因是抗结核药物的很好作用靶位。2.2细菌、化疗后残留的细菌分枝杆菌的持留指的是结核分枝杆菌在化学治疗和(或)肌体免疫压力下的生存能力。持留菌的性质目前尚不清楚,但可能是由稳定期的细菌、化疗后仍残留的细菌和(或)休眠期的细菌组成。这些持留菌的存在是结核病需要长期治疗的主要原因。目前许多研究侧重于了解持留结核分枝杆菌的生物学特性,并研制对持留菌有活性的新药。已鉴定出持留分枝杆菌的基因产物,如异柠檬酸裂解酶(ICL),PcaA,RelA和DosR与分枝菌酸的修饰有关,故这些基因产物有可能成为抗持留分枝杆菌药物的作用靶位。2.3细菌毒副反应数项研究已确定了大肠埃希菌中涉及细菌细胞的死亡和存活的毒素和抗毒素配对基因(称为TA模块),如mazEF,higAB,parDE,phd/doc,relBE,vapBC。毒素的表达不当或失控及抗毒素的表达降低均能导致细菌死亡。在大肠埃希菌中,一些可分别抑制转录和翻译的抗生素(利福平、氯霉素和大观霉素)及一些可引起胸腺嘧啶饥饿的磺胺药通过诱导毒素MazF产生而杀死细菌。已发现结核分枝杆菌基因组至少含有38个TA模块,包括3个relBE和9个mazEF,这些AT模块是设计即可诱导分枝杆菌产生毒素,又可抑制抗毒素表达药物的作用靶点。2.4非可小热发酵的能量所有细菌的生存均需要能量。在结核分枝杆菌中能量产生的途径并无明显特征,最近的研究已证明能量产生途径是药物作用的重要靶点,如吡嗪酰胺(对非生长期持留杆菌的活性比生长期杆菌更强,并缩短了治疗结核病的疗程)使结核杆菌的细胞膜破裂而耗尽能量起到杀菌的作用。这项研究提示,能量的产生和维持对于持留的非生长期结核杆菌在体内的生存非常重要。最近发现的高效TB治疗药物二芳基喹啉也证明了能量产生途径对于分枝杆菌的重要性。因此,能量产生途径,如电子传递链、糖酵解途径和发酵途径,均有可能成为结核病药物的良好作用靶位。3药物联用筛选除选择药物靶位外,还应该考虑许多不同的方法,其中之一便是药物筛选模型的设计。除吡嗪酰胺外,目前大多数抗结核药物的发现是基于其抗生长期杆菌的体外活性。而对非生长期持留菌具有活性的药物才能缩短治疗的时间,如异烟肼和利福平。因此,新药的筛选可模拟体内病灶的条件(如pH和组织缺氧),对稳定期非生长杆菌的抗菌活性是鉴定杀持留菌并缩短治疗时间的药物的重要条件。此外,通过药物联用的筛选方法可以鉴定联合用药是否具有协同作用,如可鉴定与吡嗪酰胺或利福平有协同作用的药物,以提高其抗结核作用。遵循药物联用的思路,采用系统生物学方法发现新药格外令人关注,该方法不同于常规方法,即筛选作用于单一靶位的单个药物,而是使用多种化合物以不同的作用途径同时作用于多个靶位来达到预