健脾法对非特异性免疫相关的抗肿瘤作用机制研究

健脾法对非特异性免疫相关的抗肿瘤作用机制研究

癌症是严重威胁人类生活健康的肿瘤之一，是肿瘤的第四种类型。在我国,中医中药被广泛应用于胃癌治疗中。近年来大量的临床和实验研究证实中医健脾法在胃癌的治疗中发挥重要作用,以健脾类药物为基础组成的复方治疗可纠正胃癌患者脾虚状态,具有延长胃癌患者生存期,降低术后复发转移等作用。实验表明某些健脾类中药复方不仅对裸小鼠NK细胞杀伤活性及红细胞免疫功能有调节作用,对胃癌细胞生长还具有直接的抑制作用,其机制与下调Bcl-2、STAT3等基因的表达,抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡有关。由于临床上用药以辨证为原则,复方的组成常以健脾药物为基础结合清热解毒、软坚散结等其它类中药,取得疗效往往是整方作用的结果,对健脾药物特有的作用机制了解并不全面。本研究将以往研究中证实对胃癌有效的以健脾为基础的复方全方细化分为健脾组(由全方中的健脾类药物组成)和非健脾组(由全方中非健脾类药物组成),研究健脾类药物对胃癌细胞生长的影响及对实验动物非特异性免疫功能的具体作用和可能机制。中药组成和分组中药制备:全方由太子参12.0g,炒白术12.0g,茯苓12.0g,姜半夏9.0g,青皮4.5g,陈皮4.5g,生牡蛎30.0g,夏枯草9.0g,红藤30.0g,菝葜30.0g,藤梨根30.0g等组成。健脾组由太子参12.0g,炒白术12.0g,茯苓12.0g,姜半夏9.0g,青皮4.5g,陈皮4.5g等组成。非健脾组由生牡蛎30.0g,夏枯草9.0g,红藤30.0g,菝葜30.0g,藤梨根30.0g等组成。单味中药由上海中医药大学附属龙华医院中药房提供,均按以往方法煎制。各组中药均调节浓度至120mg/mL(即每毫升含生药量计),高温高压灭菌,备用。5-氟尿嘧啶(5-FU)(上海旭东海普药业有限公司,批号:060501),乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(南京建成生物工程研究所第一分所)。2.动物分组、药物代谢和血清ifn2.1瘤种人胃癌细胞MKN-45瘤种裸小鼠由上海肿瘤研究所馈赠,经体外、体内传代,形成稳定的皮下移植瘤模型,传代至第8代(P8),进行第1次实验后,继续传代,至第13代(P13),进行第2次实验。2.2动物BALB/c-nu/nu裸小鼠6周龄,雄性,SPF级,体质量(20±2)g,抑瘤动物实验重复2次。第1次共40只[动物合格证:SCXK(沪)2007-0005,No.0044099],第2次共78只[动物合格证:SCXK(沪)2007-0005,No.0049570]。2.3造模及分组皮下移植瘤模型造模采用文献和以往的方法——组织块套管针法。造模7d后选瘤块5mm3以上的动物进行随机分组进入实验,随机分为全方组、健脾组、非健脾组、5-FU组、生理盐水组及非造模组(第2次实验),具体动物数见表。治疗组分别予相应药物0.5mL/d灌胃,1次/d;5-FU组50mg·kg-1·d-1腹腔注射,1次/周,共4周;生理盐水组:0.9%氯化钠溶液0.5mL/d灌胃,1次/d;非造模组予常规饲养。实验第31天,处死实验动物。无菌剥离瘤块,称取瘤块重量;无菌保存瘤块标本分别液氮冻存和常规石蜡包埋;摘眼球取血,提取血清。2.4抑瘤率计算方法肿瘤抑制率按以下公式计算:抑瘤率(%)=(生理盐水组平均瘤重-实验组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100%。2.5自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)细胞活性采用LDH释放法。具体操作按试剂盒说明书进行。2.6血清IFN-γ含量采用酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测血清IFN-γ含量。使用R&D公司小鼠IFN-γElisa试剂盒,具体操作按试剂盒说明书进行。DENLEYDRAGONWellscanMK3酶标仪检测。2.7脾细胞活化性受体(nature-killergroup2menberD,NKG2D)表达提取小鼠脾细胞,裂解液反应后离心,BCA法测定蛋白浓度;WesternBlot检测脾细胞NKG2D受体表达。采用半干转膜方式。一抗为RatIgG2BantimouseNKG2D,稀释1:1000。Quantityone软件进行灰度分析比较。使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。数据用表示,方差齐性检验后,采用单因素方差分析对实验结果进行统计学分析,均数间多重比较采用最小显著差法(LSD检验),显著性水准为α=0.05。各组小鼠血清nk细胞杀活性、血清ifn-、非健脾的检测比较两次实验中,全方组、健脾组、非健脾组和5-FU组平均瘤重均低于生理盐水组(P<0.01);实验一抑瘤率分别为34.40%、30.69%、26.98%、36.33%;实验二抑瘤率分别为23.68%、28.32%、38.28%、38.87%。健脾组平均瘤重与全方组相比差异无统计学意义,非健脾组与全方组相比差异亦无统计学意义,健脾组与非健脾组相比差异无统计学意义,全方组、健脾组、非健脾组和5-FU组相比,差异无统计学意义。生理盐水组的NK细胞杀伤活性较非造模组降低(P<0.01);全方组、健脾组、非健脾组均高于生理盐水组(P<0.01),5-FU组与生理盐水组相比,差异无统计学意义;全方组、健脾组、非健脾组及5-FU组均低于非造模组,差异有统计学意义(P<0.05);健脾组与全方组相比,差异无统计学意义,非健脾组和5-FU组均低于全方组,差异有统计生理盐水组血清IFN-γ含量较非造模组降低(P<0.01);全方组、健脾组、非健脾组均高于生理盐水组(P<0.01),5-FU组与生理盐水组相比,差异无统计学意义;全方组、健脾组与非造模组相比,差异无统计学意义,非健脾组和5-FU组均低于非造模组,差异有统计学意义(P<0.01);健脾组与全方组相比,差异无统计学意义,非健脾组和5-FU组均低于全方组(P<0.01)。生理盐水组NKG2D受体表达量较非造模组降低(P<0.01);全方组、健脾组、非健脾组均高于生理盐水组(P<0.01),5-FU组与生理盐水组对照相比,差异无统计学意义;全方组、健脾组及非健脾组与非造模组相比,差异无统计学意义;5-FU组低于非造模对照组(P<0.01);健脾组与全方组相比,差异无统计学意义,非健脾组与全方组相比,差异无统计学意义,5-FU组低于全方组(P<0.01)。增强nk细胞杀伤活性本研究结果发现,健脾为主的全方组及其中的健脾组和非健脾组的两次实验统计的瘤重均明显低于生理盐水组,差异具有显著性(P<0.01),提示以健脾为基础的复方全方及方中的健脾和非健脾组分均能抑制裸小鼠皮下移植瘤肿瘤生长,与以往的研究结果一致。对各实验和对照组皮下移植瘤裸小鼠脾NK细胞杀伤活性的测定结果显示,生理盐水组NK细胞杀伤活性明显低于非造模组,处于免疫抑制状态,提示造模后移植肿瘤对裸小鼠的免疫功能有明显的抑制作用;而全方组及健脾组均可上调造模裸小鼠的NK细胞杀伤活性,使之接近于非造模组的水平,表明实验中的全方组和健脾组药物可通过上调造模动物低下的NK细胞活性,提高荷瘤机体的非特异性免疫。相比较而言,非健脾组虽然也显示了上调荷瘤机体的NK细胞杀伤活性,但效果明显低于全方组和健脾组,提示健脾类中药在全方中起到上调NK细胞活性的主导作用。5-FU组的裸小鼠脾细胞中NK细胞杀伤活性较非造模组下降,与生理盐水组比较无统计学差异,提示化疗药物5-FU无明显调节NK细胞杀伤功能的作用。非特异性免疫是机体免疫的第一道防线,是生物体固有的、对高危致病因子即时反应的“非特异性”抵御外来侵袭的第一道防线。非特异性免疫功能的高低,决定了免疫系统对肿瘤发挥杀伤功能的水平高低,直接体现着机体免疫系统的免疫反应性,也是诸多学者讨论肿瘤免疫功能变化的重要指标。TAdachi等发现,抑制机体内N-乙酰半乳糖氨基转移酶可以上调胃癌患者体内NK细胞对肿瘤的免疫反应性,提高患者的肿瘤免疫功能。已有报道发现健脾扶正类药物能提高正常小鼠以及免疫抑制小鼠的非特异性免疫功能,本研究结果也证实了这一点。在机体中,应激活化的NK细胞可以产生IFN-γ,这类细胞因子具有很强的免疫调节作用,可以对NK细胞具有反馈性的激活作用,增强NK细胞的活化,从而增强NK细胞对靶细胞的杀伤作用。IFN-γ被认为是NK细胞天然诱导剂,可促进NK细胞的生长和分化,增强NK细胞的细胞毒活性,抗原依赖的细胞介导细胞溶解作用(ADCC)和NK细胞毒因子的释放。本研究中笔者进一步测定了各实验组和非造模对照组荷瘤鼠血清中IFN-γ含量,结果表明生理盐水组荷瘤鼠血清IFN-γ含量明显低于非造模组,提示移植瘤可下调模型动物血清IFN-γ含量;而全方组及健脾药物组IFN-γ含量高于生理盐水组,表明全方和健脾药物均可以上调荷瘤小鼠血清中下降的IFN-γ含量使之接近于非造模组的正常水平,从而发挥免疫协同作用以增强NK细胞杀伤活性;非健脾组虽然同样显示了上调荷瘤机体血清中的IFN-γ含量,但仍明显低于非造模组以及全方组和健脾组,进一步提示健脾药物在调节荷瘤小鼠IFN-γ中起主要的作用。而5-FU组IFN-γ含量与生理盐水组无统计学差异;同时明显低于非造模组和各中药实验组,表明化疗药物5-FU对模型动物IFN-γ无明显影响作用。NKG2D是NK细胞表面的C型凝集素活化性受体,NKG2D与肿瘤细胞表面配体结合,杀伤肿瘤细胞。NKG2D广泛地表达于多种免疫细胞,在鼠类所有NK细胞、部分NKT细胞、部分脾CDT辅助淋巴细胞、巨噬细胞都表达NKG2D。在人类中除表达于所有NK细胞外,NKG2D在未受刺激的外周血细胞、CDT辅助淋巴细胞及肠上皮内CDT辅助淋巴细胞上都有表达。NKG2D可作为协同刺激分子增强或协同其他活化性受体激活抗原特异性细胞的抗肿瘤免疫作用。NKG2D是迄今为止被鉴定出相应配体的一类非常重要的非MHC型活化性受体。在NK细胞发挥非特异性免疫功能的过程中,NKG2D的表达与相继诱导免疫细胞分泌IFN-γ的作用被认为在其中发挥了重要的免疫协同作用。IFN-γ可以继续诱导NK细胞杀伤靶细胞,发挥免疫监视作用。本研究结果显示生理盐水组裸小鼠脾细胞NKG2D蛋白表达明显低于非造模组,处于免疫抑制状态;全方组、健脾药物组和非健脾药物组均可以上调NKG2D表达水平至接近于非造模组的正常水平。而5-FU组的裸小鼠脾细胞NKG2D受体表达水平则与生理盐水组无统计学差异,提示化疗药物5-FU无明显调节NKG2D受体表达作用。结合上述血清IFN-γ含量测定和NK细胞杀伤活性测定的结果,表明全方组、健脾药物组可上调宿主脾细胞NKG2D受体表达,并相继性地诱导免疫细胞分泌IFN-γ,免疫协同性地刺激NK细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用,而非健脾药物组分虽可上调宿主脾细胞NKG2D受体表达,部分诱导免疫细胞分泌IFN-γ,并部分上调宿主的NK细胞杀伤活性,但其诱导免疫细胞分泌IFN-γ和上调宿主的NK细胞杀伤活性的作用均明显低于全方组和健脾组,提示健脾药物组分在上调荷瘤鼠的非特异性免疫中发挥了主导作用。本研究