运动前健脾、运动后补肾对力竭运动大鼠肾细胞凋亡的影响及其分子机制

运动前健脾、运动后补肾对力竭运动大鼠肾细胞凋亡的影响及其分子机制

严重疲劳或用力运动会导致肾细胞死亡。肾组织氧自由基增加、Bax蛋白表达过度或Bcl-2蛋白表达降低是导致肾细胞凋亡增加的重要原因。中医药对抗大强度运动造成机体损害的作用受到广泛重视,但从肾细胞凋亡角度探讨其作用机制的研究有限,需深入研究。从中医理论分析,运动引起的机体疲劳,脾气耗伤在先、肾元虚损在后,故运动前健脾、运动后补肾可适时补充机体气血和阴阳元气损耗,促进脾运化水湿和肾藏精泻浊的功能,以减轻对机体的损害。研究显示,在慢性疲劳性运动过程中运用运动前健脾、运动后补肾法可提高运动机体肾组织的抗氧化损伤能力。本研究以一次性力竭运动大鼠为对象,探讨该用药方式对力竭运动后肾细胞凋亡和Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,旨在为其在运动实践中的合理应用提供依据。1材料和方法1.1实验动物与大鼠的饲养与观察健康雄性Sprague-Dawley大鼠,8周龄,体重180g～220g,由湖南农学院实验动物中心提供,常规分笼、以国家标准啮齿类动物饲料饲养,自由饮水进食。室温22℃±3℃,相对湿度50%,每日光照时间15h。安静饲养与观察3日后,在坡度为0°的PT动物实验跑台(杭州立泰科技有限公司提供)上以10m/min的速度进行15min适应性跑台训练,筛选出不能进行跑台运动的大鼠。将合格大鼠按体重分层随机分为安静对照组、力竭运动组和力竭运动+前健脾后补肾组,每组8只。1.2茯苓和谐酸方用西洋参、白术、茯苓、甘草、大枣,按1∶2∶2∶2∶3的比例组成健脾方;用淫羊藿、仙茅、枸杞子、熟地黄、肉苁蓉、泽泻、山药、茯苓、牡丹皮、山茱萸,按4∶3∶4∶8∶4∶3∶4∶3∶3∶3的比例组成补肾方。两方分别加水煎煮两次,取两次煎取药液过滤、去渣合并,用烧杯在恒温水浴锅内浓缩为1g/ml,贮存于冰箱备用。给药时用双蒸水稀释,健脾方使用液的稀释浓度为25%(V/V),补肾方使用液的稀释浓度为50%(V/V)。1.3两力竭运动方案分组后次日,力竭运动组和力竭运动+前健脾后补肾组在跑台上进行一次性力竭运动。力竭运动前40min,力竭运动组灌服生理盐水,力竭运动+前健脾后补肾组灌服健脾方中药;力竭运动后40min,力竭运动组灌服生理盐水,力竭运动+前健脾后补肾组灌服补肾方中药。灌胃溶液量均为2ml。两力竭运动组按以下方案进行运动:跑台坡度为0°,分别按18m/min×10min、22m/min×10min、26m/min×15min、30m/min×15min的顺序进行运动,最后保持34m/min的速度跑至力竭。力竭标准:电刺激大鼠尾部,仍跟不上预定速度,臀部压在跑台后壁,经电刺激仍无力运动,后肢随转动皮带后拖达30s,且取下后放在平台上无力走动。1.4免疫组织化学安静组于安静状态、两运动组于力竭后24h的安静状态,采用2%戊巴比妥钠(30～40mg/kg)腹腔注射麻醉后即刻断头处死,迅速剖开腹腔摘取双肾。将右肾纵行剖开,一半置入4℃的4%多聚甲醛中固定,24h后常规石蜡包埋以备免疫组织化学测定;另一半切取1mm×1mm×4mm的肾上端皮质组织,浸入2.5%的戊二醛以备电镜观察,将余下的肾上端皮质组织投入液氮。1.5指标和测定1.5.1小鼠肝肾凋亡细胞数测定将在2.5%戊二醛溶液中固定24小时的肾皮质用2%锇酸后固定2小时,经50%、70%、90%、100%的丙酮梯度脱水(每级10分钟×3次)。1∶1的环氧树脂与纯丙酮混合液浸泡24小时后用Epon812(Epoxiaquivalentgewicht145-160)、DDSA(DodecenylsuccinicAnhydride)、MNA(Methy1NadicAnhydride)和DMP30(dimethylaminomethytphenol)60℃包埋成块。瑞典产LKB-Ⅲ型超薄切片机切片,经醋酸铀和硝酸铅双重染色后,用日产H-600型透射电镜观察拍片,并分别记录每张切片各15个连续不重叠的肾小管和肾小球视野中的凋亡细胞数,计算各组肾小管和肾小球每个视野平均凋亡细胞数。检测在湖南医科大学电镜室完成。1.5.2苏叶苏叶素检测TUNEL试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,操作严格按照试剂盒说明书,免疫组化ABC染色法,DAB显色,苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。细胞核中出现棕黄色颗粒为原位末端标记阳性细胞,即凋亡细胞。在光镜(×400)下计数每张切片10个连续不重叠视野中的阳性细胞数,计算每100个细胞中平均阳性凋亡细胞数,即凋亡指数(ApoptosisIndex,AI)。1.5.3血药浓度检测bax蛋白表达采用免疫组织化学法。检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,操作完全按试剂盒说明进行。Bcl-2和Bax蛋白的表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒,位于胞浆,偶见于胞膜或核膜,细胞核被苏木素复染成蓝色。在光学显微镜(×400)下每张切片随机观察6个视野,应用北航MIAS医学图像分析系统测定Bcl-2、Bax蛋白表达的平均光密度(MOD),MOD能较准确地反映阳性产物颜色深浅的平均状况。平均光密度值为单位面积的光密度值,即积分光密度值(IOD)除以所测量的面积,IOD是指光密度值与所测面积内阳性面积的乘积。光镜为德国LEICA公司产的LEICADMLB2型双目显微镜,MoticB5显微摄像系统产自麦克奥迪实业集团公司。TUNEL和Bcl-2、Bax蛋白检测在湖南中医学院病理室完成。1.6统计分析方法数据用平均数±标准差表示,采用SPSSforWindows11.5软件进行统计分析,计量资料先进行方差分析(One-WayANOVA),后进行多重比较,显著性水平取P=0.05。2结果2.1肾组织凋亡电镜观察安静对照组的肾近曲小管上皮细胞形态规则,细胞界线清晰,基底膜连续光滑;细胞核圆、核仁明显且居中,仅偶见核边集浓缩的凋亡样改变;胞质内线粒体分布和形态、溶酶体数量与分布正常,游离面微绒毛密集排列、刷状缘清晰可见;肾毛细血管球的结构基本正常,系膜区无增宽,凋亡细胞少。力竭运动组的肾小管上皮细胞可见胞浆水肿,线粒体肿胀、空泡化,微绒毛稀少或消失,既可见较少的细胞坏死,又可见上皮细胞染色质聚集和核破碎释放出的凋亡小体;肾小球足细胞和肾小球系膜细胞少见凋亡现象。力竭运动+前健脾后补肾组与安静对照组电镜观察结果比较相似,未见肾小管上皮细胞水肿、坏死、微绒毛消失,肾实质细胞凋亡现象少。力竭运动组肾小管上皮细胞平均每个视野的凋亡细胞数为1.08±0.90个,与安静对照组(0.40±0.52个)和力竭运动+前健脾后补肾组(0.29±0.73个)相比具有显著性差异(P<0.05);力竭运动+前健脾后补肾组与安静对照组之间差异不显著(P>0.05)。力竭运动组肾小球每个视野平均凋亡细胞数(0.70±0.82个)最高,安静对照组(0.27±0.47个)最低,力竭运动+前健脾后补肾组为0.56±0.73个,但三组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.2肾皮质组织凋亡细胞与DAB发生显色反应呈棕褐染色,而正常细胞和坏死细胞胞核则由苏木素染成蓝紫色。本实验中安静对照组大鼠肾皮质组织偶见棕褐色细胞核(见图1a),力竭运动组可见较多散在或成片状分布的棕褐色细胞核(见图1b),力竭运动+前健脾后补肾组可见细胞核染少量的棕褐色颗粒(见图1c)。力竭运动组凋亡指数(AI)显著高于安静对照组和力竭运动+前健脾后补肾组(P<0.05),后两组相比差异不显著(P>0.05)(见表1)。2.3各组bax蛋白表达的比较免疫组化检测结果显示,安静对照组、力竭运动组和力竭运动+前健脾后补肾组的肾小管胞浆均有Bcl-2蛋白表达,为褐色颗粒,力竭运动组的平均光密度值最高,但各组间的差异不显著(P>0.05)(见表1、图2)。而肾小管上皮细胞胞浆Bax蛋白表达的阳性染色为棕褐色,力竭运动组比安静对照组和力竭运动+前健脾后补肾组增强,平均光密度值差异显著(P<0.05);安静对照组与力竭运动+前健脾后补肾组的差异不显著(P>0.05)(见表1、图3)。3肾损害结果见表1,2肾脏负担泌尿、调节水电解质平衡及机体的一些内分泌功能,是维持机体内环境稳定的重要器官。急性力竭运动造成肾细胞凋亡,表现为运动后逐渐发生,24小时后于肾的皮、髓质交界及髓质见大量凋亡细胞,并以肾小管损伤最严重。力竭运动后Bax蛋白表达逐渐增强,在24小时增强明显,表明运动诱导的肾细胞凋亡数增多与自由基损伤、Bcl-2和Bax表达变化有关,Bax表达量明显增加、Bcl-2表达量减少或不变可促进肾细胞凋亡的发生。本实验结果显示:力竭运动组力竭后24小时,细胞核的棕褐染色颗粒及凋亡指数显著高于安静对照组;透射电镜下观察到肾小管上皮细胞胞浆水肿,线粒体肿胀、空泡化,微绒毛稀少或消失,有较少的细胞坏死,又见到较多上皮细胞染色质聚集和核破碎释放出凋亡小体,证实力竭运动后24小时肾细胞凋亡确实增加。肾组织损伤严重时为细胞坏死,较轻时可见细胞凋亡。大鼠肾缺血再灌注损害时可见两者同时存在,与细胞线粒体ATP下降的幅度有关。本研究结果表明,力竭运动诱发肾小管损伤,不仅存在轻度损伤细胞凋亡,也同时产生严重损伤坏死现象,与缺血再灌注损害一致。虽然力竭运动组肾小球凋亡细胞数最高,但与安静对照组和力竭运动+前健脾后补肾组差异不显著,表明一次性力竭运动对肾小管的损伤较重,对肾小球的损害相对较轻微。中医学认为,肾藏精、主水,脾主运化水谷精微和水湿,脾肾互为先后天之本,功能上相互影响。“脾外合肌肉四肢”、“劳则气耗”,运动中肌肉反复收缩脾气耗伤,将造成水谷精微耗损、湿浊内生。运动至精疲力竭之时气耗精伤,由脾及肾,两脏正气损耗。同时,运动过程中物质代谢加强产生的过多水湿邪浊将壅积伤肾。作为损害因子出现的运动源性自由基和Bax蛋白等物质成份属于中医的“邪浊”范畴,因此,单纯力竭运动组肾细胞产生多种肾损害结果。而运动前补脾可促进过量运动造成的湿浊运化的清除,运动后补肾能增强肾精化肾气、肾阴阳充足和肾主水泻浊的功能,提高体内水湿邪浊的清除能力,减轻肾损伤。本研究结果显示力竭运动+前健脾后补肾组大鼠的肾细胞凋亡指数低于单纯力竭运动组,力竭运动诱导的肾细胞凋亡受到抑制,且电镜下肾小管未见坏死,表明运动机体的肾损伤与精伤邪浊壅积有关,同时从细胞凋亡角度证实运动前健脾、运动后补肾对运动机体肾组织有保护作用。已有的研究表明,慢性疲劳性运动中前健脾后补肾能降低肾组织的自由基损害,本实验中力竭运动+前健脾后补肾组大鼠力竭后24小时肾细胞凋亡减少,可能与其降低力竭运动机体肾组织自由基损害有关。为进一步探讨其机制,本实验进行了肾组织细胞免疫组化检测,结果显示,三个实验组大鼠的肾小管Bcl-2蛋白表达染色颗粒平均光密度值差异不显著,而力竭运动组肾小管Bax蛋白表达比安静对照组和力竭运动+前健脾后补肾组染色增强、平均光密度显著增高。在肾损害中,Bax扮演重要角色,Bax蛋白过表达将通过自身形成Bax/Bax同源二聚体或与Bcl-2形成Bcl-2-Bax异源二聚体,抑制Bcl-2活性启动肾细胞凋亡程序。本实验结果与以往的相关研究报道一致。而运动前健脾、运动后补肾的力竭运动大鼠,促