新型食品发酵重点

发酵的定义狭义“发酵”的定义在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量，丙酮酸被复原为乳酸而获得能量等等。广义“发酵”的定义工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培育的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气〔有氧〕培育的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品即有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。发酵工程〔FermentationEngineering〕的定义发酵工程，是利用“生物细胞”的特定功能，通过现代工程技术手段〔主要是发酵罐生产各种特定的有用物质，或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种生物技术体系。这里的“生物细胞”包括微生物细胞和动物、植物细胞及其固定化细胞。因此，发酵工程使渗透有工程学的微生物学，是发酵技术的工程化。发酵工程是化学工程与生物工程技术相结合的产物，它将微生物学、生物化学、化学工程学等的根本原理和技术有机地结合在一起，利用微生物进展规模化生产，是生产加工与生物制造实现产业化的核心技术。发酵工程技术主要包括供给高性能生产菌种的菌种技术、实现低本钱大规模生产产品的发酵技术和最终获得合格产品的分别纯化技术。进展发酵工程的关键技术〔菌种技术、发酵技术和分别技术〕及重大产品的争论开发，将发挥中国丰富的生物资源优势，提高发酵工程的技术水平，促进生物化工、生物医药、食品加工等相关行业的产品竞争力和可持续进展。扩大培育，发酵设备选择及工艺条件掌握，发酵产物的分别提取，废弃物的回收和利用等。发酵工程的产品可分为以下六大类：〔1〕微生物菌体细胞如酵母菌、食用菌、微生物农药的生产。〔2〕微生物酶类如各种酶种、酶制剂和各种曲类的生产。〔3〕微生物代谢产物如初级代谢产物氨基酸、有机酸、有机溶剂、核苷酸、蛋白质、核酸和维生素等，次级代谢产物抗生素、生物碱和植物激素的生产等。〔4〕微生物的转化产物利用微生物代谢过程中的某一种酶或酶系将一种化合物转化成含有特别功能基团产物的生物化学反响。如将甘油转化为二羟基丙酮，将葡萄糖转化为葡萄糖酸，将山梨醇转化为L-山梨糖等。特别是甾体激素的转化受到了广泛的重视。〔5〕工程菌发酵产物2070年月兴起的基因工程和细胞工程，取得了飞跃的进展。通过基因工程和细胞工程制造出许很多多的具有特别功能的“工程菌”，用发酵技术可以生产出更多更好的产品，发挥更大的经济效益。〔6〕酶，利用植物细胞培育技术生产自然食用色素等。发酵的类型依据发酵的特点和微生物对氧的不同需要，可以将发酵分成假设干类型：(1)按发酵原料来区分：糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。(2)按发酵产物来区分：如氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等。(3)按发酵形式来区分，则有：固态发酵和深层液体发酵。(4)按发酵工艺流程区分则有：分批发酵、连续发酵和流加发酵。(5)按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为：厌氧发酵和需氧发酵〔通风发酵〕两大类型。发酵工程的特点〔1〕发酵工程使用的原料来源广泛，多为农副产品，其中以碳源为主，只参加少量有机和无机氮源，不含有毒物质。〔2〕发酵工程的反响过程比较温顺，通常在常温、常压下进展。而且，反响过程是以生物体的自身调整方式进展，多个反响就像是一个反响一样，可在单一设备中进展，因此一种设备可有多种用途。〔3〕简洁进展简单的高分子化合物的生产，如酶、化学活性体等。〔4〕能够高度选择性地进展复制化合物在特定部位的反响，如甾体化合物的氧化、复原等。〔5〕生产产品的微生物菌体本身也可作为发酵产物。例如，富含蛋白质、酶、维生素的单细胞蛋白等。〔6〕发酵过程是纯种培育过程。生产中使用的设备、管道、截门和培育基都必需严格灭菌，通入的空气也应当是无菌空气。在操作中应特别留意严格防止污染，尤其要防止噬菌体的侵入，否则，会引起重大的损失。〔7〕生产力量，可以到达事半功倍的效果。〔8〕在发酵生产中，还可以通过改进工艺技术和设备来提高产品的产量和质量。基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌’来进展反响；反响设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反响器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有根底上有所提高和和创。发酵工程也有一些问题需要引起重视：〔1〕中除了有四环素外，还会有金霉素、差向四环素、脱水四环素等副产物。这些副产物的存在，给提取和精制带来了肯定的困难。〔2〕一方面受细胞自身的影响，所以工艺掌握比较困难，生产波动比较大。〔3〕发酵工程需要的关心设备多，如空气压缩机、空气净化系统、冷却水系统、灭菌用蒸汽系统等。因此，动力费用比较高。〔4〕发酵中，由于底物浓度不能过高，导致需要使用大体积的反响器。〔5〕发酵废液中具有较高的CODBOD，排放前，必需经过处理。发酵工程的应用范围〔1〕发酵工程在食品工业上的应用食品工业是世界上最大的工业之一，也是微生物技术最先开发应用的领域。例如以糖类物质为主要原料酿造葡萄酒、白酒、黄酒和啤酒，以牛奶为原料生产奶酒、奶酪、酸奶等发酵乳制品，以淀粉类物质为主要原料生产谷氨酸、赖氨酸等，以豆类和谷物为原料生产酱油、醋、腐乳和泡菜等，以及用各种原料生产单细胞蛋白等。近年来，发酵工程应用于食品生产和开发，促进了食品工业的飞速进展，主要表达在四个方面：一是对食品资源的改造与改进；二是将农副原材料加工成商品，如酒类、调味品等发酵产品；三是对产品进展二次开发，形成的产品，如很多食品添加剂等；四是对传统食品加工工艺进展改造，降低能耗，提高产率，改善食品品质等。发酵工程的进展史1.6.1自然发酵阶段 19世纪，人们利用自然发酵现象，从事酿酒、酱、醋、奶酪等“发酵”的本质的了解，直到19世纪末仍旧是一知半解。因此，当时完全是凭阅历而进展家庭作坊式生产，时常被杂菌污染所困扰。可见19饮料酒、酒精、酱、酱油、醋、干酪、酸乳及酵母等。多数产品为嫌气发酵，非纯种培育，凭阅历传授技术，产品质量不稳定是这个阶段的特点。1.6.2微生物纯培育技术的建立-列文虎克(AntonievanLeeuwenhoek)〔当时被称为微小动物20019世纪中叶，巴斯德通过著名的Pasteur试验，证明白发酵原理，指动身酵现象是微小生命体进展的化学反响。其后，他连续对当时的乳酸发酵、酒精发酵、葡萄酒酿造、食醋制造等各种发酵现象进展争论，明确了这些不同“酒精发酵〔醋酸菌〕”免受酸败之苦。巴斯德也因此被人们誉为“发酵之父”。〔Brefeld〕〔1872年〔Hansen〕建立了啤酒酵母的纯粹培育发酵1878年；柯赫KochR〕完成了细菌纯粹培育技术〔1872年，从而确立了单种微生物的分别和纯粹培育技术，使发酵技术从自然发酵转变为纯粹培育发酵。为此，人们设计了便于灭除其他杂菌的密闭式发酵罐以及其他灭菌设备，开头了乙醇、甘油、丙酮、丁醇、乳酸、柠檬酸、淀粉酶和蛋白酶等的微生物纯种发酵生产，与巴斯德以前的自然发酵是两个迥然不同的概念。此阶段称为发酵工程的第一个里程碑——以微生物的纯种培育技术为主要特征。1.6.3微生物液态深层发酵技术的建立1929年，弗莱明〔FlemingA〕觉察了青霉菌能抑制其菌落四周的细菌生长的现象，并证明白青霉素的存在。但由于当时青霉素的产量格外低，并未受到广泛重视。其1940年，钱恩〔ChainEB〕和弗洛里〔FloreyH〕两位博士精制出青霉素，并确认青霉素对伤口感染症比当时的磺胺药剂更具疗效，加上其次次世界大战爆发，青霉素作为医治战伤感染的药物而大力推动了青霉素的工业化生产和争论，成功创立了液态深层发酵技术。承受液态深层发酵技术，再配以离心、溶剂萃取和冷冻干燥等技术，使青霉素的生产水平有了很大提高，其中发酵水平从液体浅盘发酵的40U·mL-1200U·mL-1〔1943年。随后，链霉素、金霉素等抗生素相继问世，抗生素工业快速崛起。此阶段称为发酵工程的其次个里程碑——以微生物液态深层发酵技术为主要特征。1.6.4微生物酶转化及代谢调控技术的应用1950年—1960飞速进展，再加上型分析方法和分别方法的进展，发酵工程领域有了两个显著进步。其一是承受微生物进展甾体化合物的转化技术，其二是以谷氨酸等发酵生产成将载体转化成副肾上腺皮质激素、性激素等技术，进展了格外广泛争论，结果几个1956年由日本的木下祝郎弄清楚了生物素对细胞膜通透性的影响，在培育基中限量供给生物素影响了膜磷脂的合成，1957年，日本将这一技术应用到谷氨酸发酵生产中，从而首先实现了L-谷氨酸的工业化生产。谷氨酸工业化发酵生产的成功促进了代谢调控理论的争论，承受养分缺陷型及类似物抗性突变株实现了L-赖氨酸、L-苏氨酸等的工业化生产。此阶段称为发酵工程的第三个里程碑——以微生物酶转化及代谢调控技术为主要特征。1.6.5微生物发酵原料的拓宽1960年~1970年这段时期，微生物代谢调控技术在发酵工程中得到了广泛的应用，发酵原料多样化开发争论的开展，促进了单细胞蛋白发酵工业的兴起，使发酵原料由过去单一性碳水化合物向非碳水化合物过渡。从过去仅仅依靠农产品的状况，过渡到从工厂、矿业资源中查找原料，开拓了非粮食〔如甲醇、甲烷、氢气等〕发酵技术，拓宽了原料来源的途径。此时期称为发酵工程的第四个里程碑——以发酵原料的转变或拓宽为主要特征。1.6.6微生物基因工程育种1953年，WatsonJDCrickFHC提出了DNA的双螺旋构造，为基因重组奠定了2070DNA技术的进展，人们可以按预定方案把外源目的基因克隆到简洁大规模培育的微生〔如大肠杆菌、酵母菌〕细胞中，通过微生物的大规模发酵生产，即可得到原先只有动物或植物才能生产的物质，如胰岛素、干扰素、白细胞介素和多种细胞生长因子等。从过去繁琐的随机选育生产菌株朝着定向育种转变，这给发酵工程带来了划时代的变革，被称为发酵工程的第五个里程碑——以引入基因工程，到达微生物定向育种为主要特征。思 考 题什么是发酵？发酵工程是指什么？发酵工程经受了几个主要的进展阶段？发酵工程的内容及特点是什么？2章发酵工业菌种选育工业发酵生产水平的凹凸取决于生产菌种、发酵工艺和后提取工艺三个因素，其中拥有良好生产菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品的产量、质量及其本钱。例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有40U·mL-1，得到黄色晶体，青霉素纯度很低，价比黄金；而现在承受型菌种可以到达60000U·mL-1以上，得到晶体为纯95%0.1元。青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种在其中起了关键作用。菌种选育有何意义？菌种选育的意义：供给产量提高产品质量改善加工工艺和开发产品。在科学争论中，通过菌种选育还可以了解菌种的遗传学性质代谢作用是生物体维持生命活动过程中的一切生化反响的总称，是生命活动的最根本特征，与生命的存在、进展严密相联。依据代谢产物的生理作用不同，将代谢分为初级代谢和次级代谢两种类型。初级代谢主要是指把养分物质转化为机体构造和生理活性物质以及供给能量的代谢作用。微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长生殖所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中间代谢物、前提物、高分子物质以及能量代谢和代谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖和核酸等。次级代谢是微生物在肯定的生理阶段消灭的一种特别代谢类型，是某些微生物为了避开在代谢过程中某些代谢产物的积存造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢产物通常是在生长后期合成。次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，如抗生素、生物碱、色素、激素和毒素等，这些产物是对微生物本身无明显生理作用或对自身生长是非必需的，但对产生菌的生存可能有肯定价值。工业发酵对生产菌种的一般要求〔1〕安全性。〔2〕有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的力量。〔3〕物质的转化率，削减分别纯化的难度，降低本钱，提高产品的质量。〔4〕生长生殖力量强，生长、反响速度快，发酵周期短，产孢菌应具有较强的产孢子力量。〔5〕原料来源广，价格低廉，菌种能高效地将原料转化为产品。〔6〕对需要添加的前体物质有耐受力量，并不能将前体作为一般碳源利用。〔7〕菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体力量强，以保证发酵生产和产品的稳定性。工业发酵生产菌种来源从自然界分别筛选。自然界是菌种和优良菌种的宝库。但一般从自然界直接分别到的菌种，大多数不能马上适应实际生产需要。由于在正常生理条件下，微生物的主要特性是快速生长和生殖，但是，发酵工业的目的主要是积存大量的代谢产物。因此从自然界分别到的菌种往往要通过菌种改进即菌种选育，才能得到符合工艺要求的菌种。从菌种保藏机构获得。这些菌种离生产工艺要求已根本接近或接近，稍加选育即简洁获得优良菌种，可节约人力和时间。从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优良菌种。化。选择和培育适合的优良菌种是重要的环节。菌种选育就是依据生产的要求，依据微生物遗传和变异的理论，用自然或人工的方法造成菌种变异，再经过筛选而到达菌种改进的目的。菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种。自然选育概念：〔SpontaneonsMutatiton〕而进展菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分别。自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。称它为自然突变绝不意味着这种突变是没有缘由的。一般认为引起自然突变有两个缘由：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量的诱变效应，是指自然突变实质上是由一些缘由不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如布满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质〔如过氧化氢〕的作用等。所谓互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶〔T〕和鸟嘌呤〔G〕可以酮式或烯醇式消灭，胞嘧啶〔C〕和腺嘌呤〔A〕可以氨基式或亚氨基DNA双链构造中以AT和GC碱基对为主。可是在偶然状况下，TDNA复制到达这一位DNA多聚酶的作用，在它的相对位置上就不消灭AG。同样，假设C以稀有的亚氨基形式消灭，在合成的DNA单链的相对位置上就将是A而不是G。这或许就是发生相应的自然突变的缘由。由于在任何一瞬间，某一碱基是处于酮式或烯醇式还是氨基式或亚氨基式状态目前还无法推测，所以要预言在某一时间、某一基因将会发生自然突变是难以做到的。但是，人们对这些偶然大事作了大量统计分析后，还是可以觉察并把握其中规律的。例如，据统计，碱基对10-8~10-9。自然突变有两种状况，一种是生产上所不期望有的，表现为菌种的衰退和生产质量的下降；另一种是对生产有益的。为此，为了确保生产水平不致下降，生产菌株经过肯定时期的使用后须纯化，淘汰衰退的；保存优良的菌种。这就是通常所指的菌株的自然分别。自然选育是一种简洁易行的选育方法，它可以到达纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度的提高。因此，常常把自然选育和诱变育种交替使用，这样可以收到良好的效果。自然选育〔自然分别〕的一般程序，是把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进展分别，挑取局部单菌落进展生产力量的测定，经反复筛选，以确定生产力量更高的菌株代替原来的菌株。自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为简单，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简洁。因此，下面以从自然界中选育菌种的过程为例，阐述菌种自然选育的主要步骤。其具体做法一般分为四个步骤：样品采集、增殖培育、纯种分别和筛选等。假设产物与食品制造有关，还要对菌种进展毒性鉴定2-2。土壤往往是首选的采集目标微生物的养分需求和代谢类型与其生长环境有很大关系。富集培育由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，假设估量到要分别的菌种数量不多时，就要富集培育。假设采集样品中需要的菌种原来就多，就不需要再作富集培育，直接进展分别即可；假设一次增殖数量不够，可以连续进展富集培育，直至到达分别要求。为了所需菌种增殖后在数量上占优势，一般人为地参加肯定的限制因素。该种限制因素需依据具体状况而定。常用的有两种方法，一是掌握肯定的养分，二是掌握肯定的培育条件。掌握培育基的养分是依据目的菌种的养分特性，在增殖培育基中参加相应的底物作为唯一碳源或氮源，样品中能够分解利用底物的菌株因养分充分而快速生殖，而其他微生物则由于不能分解利用底物致生长受到抑制。富集培育基的选择性只是相对富集培育还可以通过掌握肯定培育条件以到达有效分别的目的。可承受高温、高压、参加抗生素等方法抑制非目的菌株的生长，以使目的菌株的比例增加。所以增殖培育在菌种选育过程中是很关键的一步。常用的纯种分别方法有三种，即划线分别法、稀释分别法和组织分别法。要在平板上得到纯的菌落，关键步骤是制备单孢子或菌体悬浮液。微生物，如霉菌。组织分别法适用于分别高等真菌。在具体应用中承受哪种方法状况而定。培育条件的掌握：①养分成分掌握②掌握培育基的酸碱度③添加抑制剂④热处理⑤掌握培育温度⑥通气条件的掌握初筛可分为两种状况进展平板筛选摇瓶发酵筛选微生物选择性分别的原理和方法在菌种的分别筛选过程中，为了提高筛选的效率，通常要依据菌种的特性，设计具有选择性的分别筛选方案，通过掌握养分和培育条件以有利于待分别菌株的生长和抑制非目的微生物的生长，或通过添加显色剂、指示剂以便利待分别菌株的选择。在常见选择性分别方法中，除了掌握培育基养分成分和掌握培育条件外，还有依据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反响来设计选择培育基，通过观看微生物在选择培育基上生长状况或生化反响进展分别的方法。这种利用平板的生化反响进展分别的方法有以下几种：①变色圈法;②透亮圈法;③生长圈法;④抑菌圈法.承受抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。诱变育种诱变育种的根本原理诱变育种的理论根底是基因突变。所谓基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。染色体畸变是指染色体或DNA片段的缺失、易位、逆位、重复等，而基因突变是DNA分子构造中的某一部位发生变化〔又称点突变。依据突变发生的缘由又可分为自然突变和诱发突变。所谓自然突变是指在自然条件下消灭的基因突变，而诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三2-6。经诱变处理后，微生物的遗传物质，DNA和RNA的化学构造发生转变，从而引起微生物的遗传变异。由于引进了诱变剂的处理，故诱变育种使菌种发生突变的频率诱变育种的一般步骤利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过肯定的筛选方法，猎取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。诱变育种包括诱变和筛选两个局部。诱变局部包括由动身菌株开头，制出颖孢子悬浮液〔或细菌悬液〕作诱变处理，然后以肯定稀释度涂平皿，至平皿上长出单菌落等各步骤。因诱发突变是使用诱变剂促使菌种发生突变，所以诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有亲热关系，亦可说这三者是诱变局部的关键所在。筛选局部包括经单孢子分别长出单菌落后随机挑至斜面，经初筛和复筛进展生产能力测定和菌种保存〔马上筛选出来的高产菌种保藏好。因此，可以认为，诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较抱负的高产菌株。最终经考察其稳定性、菌种特性、最适培育条件等后，再进一步进展中试、放大。诱变育种应留意的问题 诱变成功的关键包括动身菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法等。〔1〕动身菌株的选择〔parentstrai生产性状的力量或潜力、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广等条件。动身菌株通常有三种：一是从自然界分别得到的野生型菌株；二是通过生产选育，即由自发突变经筛选而得到的高产菌株；三是已经诱变过的菌株，这类菌株作为动身菌株较为简单，一般认为已经诱变获得的高产菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难，但有些高产突变往往需要经过逐步累积的过程，进展多步诱变可以获得高产菌株。诱变因素的选择在微生物诱变育种中，诱变处理主要承受物理诱变剂和化学诱变剂。目前常用的诱变剂主要有紫外线、γ射线、硫酸二乙酯、亚硝基胍和亚硝基甲基脲等。后两种因有突出的诱变效果，被誉为“超诱变剂”。诱变的方法有单一诱变剂处理和复合诱变剂处理。选择诱变剂时应考虑使用的便利性和有效性，假设经过诱变，正突变株消灭率较高，所用的诱变剂则为有效诱变剂。对于野生菌株，使用单一诱变因素有可能取得较好的效果；但是，对于已经诱变过的菌株，单一诱变因素重复使用的效果不佳，这时可利用两种以上诱变因素交替使用，以提高诱变效果。诱变剂剂量的选择各种诱变剂有不同的剂量表示方法，例如，紫外线的强度是尔格〔1erg=10-7，X〔R〕或拉德(rad)的浓度和处理时间来表示。但是，仅承受诱变剂的理化指标掌握诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有肯定关系，因此，可用致死率作为各种诱变剂的相对剂量，用以选择各种诱变剂的剂量。对不同的微生物使用的剂量不同，通常状况下，高剂量诱变剂处理后获得的负突变率较高，而在偏低的剂70%~80%时的剂量。但是，在多核细胞中，仍旧承受高剂量，由于在高剂量诱变时，除个别核发生突变外，其他核均被致死，可形成较纯的变异菌株，同时也造成遗传物质的巨大损伤，可削减回复突变。单孢子〔或单细胞〕悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必需是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。细胞的生理状态对诱变处理睬产生很大的影响，细菌一般在对数生长期的诱变处理效果较好，而霉菌和放线菌的分生孢子在稍加萌发时进展诱变处由于在很多微生物的细胞内同时含有几个核，即使使用单细胞悬液进展诱变处理，还是简洁消灭不纯的菌落。因此，获得单细胞悬液的方法必需具有针对性，对产孢子或芽孢的微生物最好承受其孢子或芽孢。例如，诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。常用的物理诱变剂处理方法紫外线诱变γ射线诱变太空育种常用的化学诱变剂处理方法亚硝酸诱变亚硝基胍〔NTG〕诱变杂交育种杂交育种一般指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重组合，从中分别和筛选出具有性状的菌株。杂交育种是选用性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状集中于组合体中。因此，杂交育种具有定向育种的性质。原生质体融合就是用酶法将细胞膜外的细胞壁除掉——原生质体，将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂〔或促进剂〕例如聚乙二醇和Ca2+等溶液中等量混合起来，使原生质体外表形成电极性，相互之间易于吸引、脱渐增大而实现原生质体融合。原生质体融合技术有以下优点：〔1〕去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合，交换，实现重组，不需要有的遗传系统。即使是一样接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对原生质体进展转化和转染。〔2〕四个，这是一般常规杂交所达不到的。〔3〕重组频率特别高，由于有聚乙二醇等作助溶剂。〔4〕再组合到一个单株中。〔5〕可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组子。这样往往可以提高筛选效率。菌种保藏的原理菌种退化：是指优良菌种的群体中消灭某些生理特征和形态特征渐渐减退或丧失，而表现为目的代谢产物合成力量下降的现象。在形态上，常有分生孢子削减或菌落颜色的转变，如放线菌和霉菌在斜面上经过屡次传代后产生了“光秃型”。在生理上，有的是菌种的发酵力〔如糖、氮的消耗力量〕下降，有的是生殖力〔如孢子的产生力量〕下降，有的是发酵产品得率下降，有的是抗不良环境力量减弱，全部这些都给发酵生产带来不利影响。菌种退化不是突然发生的，而是从量变