分子生物学实验备考整理

分子生物学实验备考整理使用说明：根据学长留下的资料以及鲸鱼的备考10题整合，并加入了某老师考前复习提及的内容，错误之处，还请提出。杨琳希2015.4.26实验一血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理：血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子的形式存在，分子大小，形状也各有差异，所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β、γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色结果：A、α1、α2、β、γ思考题：什么方法可以证明醋酸纤维薄膜有无电渗作用？答：在充分浸泡巴比妥容颜的醋酸纤维薄膜上点样有颜色不带电荷的染色剂，再通电进行电泳。若染色剂也随之运动则有电渗作用。实验二聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳-1分离蛋白质原理：利用两性电解质载体在电场中构成的连续pH梯度，使蛋白质在通以直流电时聚焦在与其等电点相同的ph位置上，是等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带得到分离。与聚丙烯酰胺凝胶电泳-2的异同：同皆为电泳，可用于物质的分离与鉴定异2利用蛋白质分子大小形状的差异进行分离，1利用的是两性电解质形成的光滑pH使蛋白质停留在与其pI相等的位置上进行分离；2有扩散的作用，1无扩散作用，因而物质更集中，分辨率高；电泳时间加长，2电泳效果会变差，1可使同一蛋白区带更狭窄，利于分辨。Ampholine：在直流电场作用下，能从正极到负极形成一个pH逐渐升高的平滑连续而且稳定的pH梯度，从而在电泳中实现等电点不同的物质的分离；AP：引发凝胶的聚合；TEMED：加速凝胶的聚合。实验四免疫电泳和对流免疫电泳原理：免疫电泳是将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法。首先根据抗原中各种蛋白质组分的电荷和分子量大小的不同，在电场作用下有不同的迁移率，从而可将抗原混合物中的各种不同组分分开，然后使其与特异性抗体进行双向扩散，发生免疫学沉淀反应。对流免疫电泳是电泳技术与双向琼脂扩散技术相融合而形成的一种定向加速的凝胶内免疫沉淀反应。与双向琼脂扩散技术中抗原与抗体分别向四周自由扩散不同，对流免疫电泳在凝胶中加一直流电场，抗原和抗体受到电泳和电渗两种力量的综合作用而向某一方向定向加速移动，因此可以提高灵敏度，明显缩短反应时间。实验五凝胶柱层析分离鉴定蛋白质原理：利用交联葡聚糖凝胶G-50的凝胶过滤作用，将脲酶和胰岛素分开，以Folin-Denis反应检查流出液中的蛋白质。此反应主要靠蛋白质中的酪氨酸和色氨酸与含磷鉬钨酸的酚试剂生成蓝色鉬蓝，蓝色深浅与蛋白质含量成正比关系。以纳氏试剂检查脲酶活性，此反应是先将脲酶流出液分解尿素产生胺，而氨可与纳氏试剂作用生成黄色的碘代双汞胺。脲酶试剂：分子筛层析结果：先分离出脲酶，再分离出胰岛素，出现两个峰值实验六DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析原理：聚酰胺薄膜层析是一类较特殊的吸附分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离的物质与聚酰胺薄膜上的酰胺基团形成氢键，各种物质形成氢键能力强弱不同，决定了吸附力的差异，吸附力强展层速度较慢，吸附力弱展层速度较快，同时展层溶剂与被分离物质在聚酰胺粒子表面竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间分配系数产生最大差异。一般讲，易溶于展层剂的所受到的动力作用大，展层速度块，反之速度就慢。通过各物质的吸附力和分配系数不同，使得被分离的物质在聚酰胺薄膜层析中得到分离。聚酰胺薄膜：由于分离物质和展层剂的不同，其与聚酰胺薄膜上的酰胺基团竞争形成氢键的能力也不同，从而可以利用其泳动速度差异，实现不同种物质的分离。结果：聚酰胺薄膜上出现9～10个点。思考题：可否用本法分离核苷和核苷酸，为何？答：可以。核苷酸含有磷酸，极性较强，与吸附剂形成氢键的能力更高，故可分离。*比较双向聚丙烯酰胺薄膜层析-1和凝胶柱层析-2同都是层析方法，可用于分离物质；固定相均为固体，流动相均为液体；与分离物质不发生反应，分离后可鉴定。异1属于特殊的吸附分配层析，2属于分子筛层析；1通过荧光观察判断分离物质，2通过收集液的显色反应；1原理与分离物质与聚丙烯酰胺薄膜形成氢键有关，2利用分子颗粒大小有关。实验十小鼠脾单个核细胞的分离-密度梯度离心法原理：本次实验根据颗粒沉降原理，将不同密度的小鼠脾脏细胞置于淋巴细胞分离液上进行水平式离心，使单个核细胞在其沉降运动中位于分离液洁面上；达到分离小鼠脾单个核细胞的目的。已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的密度约为1.088，而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088。因此，用密度为1.088±0.001的淋巴细胞分离液通过密度梯度离心方法，可从小鼠脾脏细胞分离得到单个核细胞。而分离人单个核细胞的淋巴细胞分离液密度为1.077±0.001.思考题1：用Ficoll-Hypaque分层液分离淋巴细胞的原理是？得到的都是淋巴细胞？答：颗粒沉降原理。密度梯度离心使血液中各组分按不同密度重新分布。思考题2：设计实验从小鼠脾脏细胞中分离得到CD4+T细胞答：免疫磁珠细胞分选法。CD4+T细胞与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，非CD4+T细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。实验十三蛋白质定量测定方法-标准曲线法测定蛋白质含量原理：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与铜离子络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行鉴定。其他蛋白质含量测定法：微量凯氏定氮法，Folin-酚试剂法，紫外吸收法，考马斯亮蓝法，BCA比色法，标准管法。实验十五PCR一、检测β-actin基因原理：该技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的情况下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段DNA片段来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起点，沿模板5’→3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。而新合成的链又可作为下一轮反应的模板，如此循环往复，每循环一次，DNA分子数即按指数倍增（2n）。试剂作用：DNA样品：提供DNA合成的模板引物：提供3’-OH末端，特异性扩增，界定扩增范围，启动DNA双链的合成4种dNTP：双链合成的原料TaqDNA聚合酶：5’→3’聚合，3’→5’内切其他试剂：Mg2+：Taq酶活性中心需要Tris-HCl：提供最适pH:6.8~7.8，保持酶的活性并帮助DNA解除缠绕结构KCl：促进引物退火（使引物加到DNA链上）明胶：稳定酶的作用防污染措施：1）划分操作试验区，并保持特定秩序2）使用一次性手套口罩帽子3）建立小包装试剂和一次性实验用品，放于冰箱指定区域4）打开试剂时短暂离心5）建立适当的阳性和阴性对照6）改进实验操作二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段原理：在pH8.0-8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同（忽略碱基上的部分电荷，每个核苷酸残基都带二个负电荷），因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的琼脂糖凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。染色剂：溴乙锭（吖啶橙）结果：在紫外灯下可以看见220bp的荧光带出现在溴酚蓝的后面。DNA片段的荧光强弱由DNA含量决定，而DNA的迁移率反映了DNA片段的大小。思考题：迁移率取决于哪些条件？答：分子大小、高级结构、胶浓度、电场强度实验十六Trizol法抽提总RNA思考题：如何有效防止RNA酶对RNA的降解？答：实验中必须戴一次性口罩手套；250℃烘培器皿4h；除含Tris试剂之外的试剂用DEPC处理；使用特异性RNA酶抑制剂思考题2：RNA能否用于后续实验的常用鉴定方法。答：波长260/280光吸收比值，1.8-2.0之间纯；电泳，紫外光激发下两条带若清晰并且28s是18s的两倍以上，纯实验十九双向琼脂扩散试验原理：双向免疫扩散试验是将抗原抗体分别加入琼脂凝胶板上的小孔中，使两者相互自由扩散，经一定时间后，若特异性结合，即在比例适当处形成可见的白色沉淀线。根据沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀线间的关系，对抗原或抗体做定性分析。实验二十ELISA—双抗体夹心法原理：将可溶性的抗原或抗体吸附到固相载体上，并保持其免疫活性，使之结合并吸附抗体或抗原，通过洗涤去除未结合成分，再与酶标记的抗体或抗原结合，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被催化变为有色产物，根据反应颜色的深浅进行免疫反应的定性和定量的方法。操作过程：①用一直抗体包被固相载体；②加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合；③加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。注意事项：①对倍稀释抗原混匀时不要产生太多气泡；②酶标板要洗涤干净不要交叉污染；③加样时从最低稀释度逐一加至最高稀释度。实验二十一细胞膜表面抗原检测—补体依赖的微量淋巴细胞毒试验思考题1：抗体与淋巴细胞表面的膜抗原特异性结合后，如何导致靶细胞的溶解死亡？答：与补体结合后通过一系列反应产生C5转化酶，裂解C5，得到C5b，后与C6C7C8n个C9结合形成MAC，在细胞膜上穿孔，导致靶细胞裂解死亡。思考题2：何种技术鉴别死活细胞？答：1、染色排除法：不容易穿过活细胞的酸性染料渗入死亡细胞内使其着色；2、荧光排除法石蜡油：密封细胞反应板，防止污染，利于孵育；抗淋巴血清：作为抗体提供补体结合位点与补体结合，使其活化形成MAC；细胞培养液：作为抗体的阴性对照；补体：与抗体的补体结合位点结合，活化形成MAC，检测是否有特异性抗原；锥蓝：使死细胞着色，通过光学显微镜观察，可以测得死细胞百分率。实验二十五蟾蜍血细胞的体外融合PEG：具有强烈的吸水和凝聚沉淀蛋白质的作用，可改变细胞膜的结构，使两细胞接触点处脂类分子发生分散和重组，引起细胞融合。实验二十七动物染色体的制备秋水仙素：抑制纺锤体形成，使细胞周期停留在中期，便于观察。KCl低渗溶液：使得细胞膨胀，利于中期染色体的观察。综合实验EDTA：络合二价金属离子，当Mg2+被络合后，细胞内释放出来的DNA酶被抑制，避免DNA的降解，同时金属离子络合后，细胞膜稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS：使蛋白质变性，能破坏膜蛋白的构象，使膜裂解，又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。其他：两种核酸提取的基